MiRNA—351在小鼠卵泡發(fā)育中的調(diào)控作用實(shí)驗(yàn)

董靜文+黃青

[摘要]目的探究MiRNA一351在小鼠卵泡發(fā)育中的調(diào)控作用。方法選取60只雌性白鼠開展實(shí)驗(yàn)，分別于出生第5、7、11、14天和第20天處死（每次處死12只），獲取卵巢后經(jīng)相應(yīng)處理并采取RT-PCR測定不同時刻MiRNA-351表達(dá)情況，并分析該基因表達(dá)在小鼠卵泡發(fā)育中調(diào)控作用。結(jié)果不同卵泡發(fā)育階段MiRNA-315表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；不同卵泡發(fā)育階段顆粒細(xì)胞凋亡水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；和Mimics-351組增殖效能相比較，Inhibitor-351水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)降低，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論MiRNA-351在小鼠卵泡發(fā)育各個過程中可能均有參與，且對增殖和凋亡水平均有調(diào)控作用，值得進(jìn)一步深入探究。

[關(guān)鍵詞]MiRNA-351；小鼠；卵泡發(fā)育；調(diào)控作用

雌性哺乳動物生殖過程十分復(fù)雜，并且呈現(xiàn)動態(tài)性周期變化。在卵巢生長發(fā)育過程中，卵母細(xì)胞生長、成熟、受精以及著床等均是維持正常妊娠必不可少的過程，而卵泡是卵巢生殖功能最為重要的部分，承擔(dān)著生命繁衍的重要使命。近年來隨著對人類生殖功能研究不斷深入，人們對微小RNA在卵泡發(fā)育過程中作用認(rèn)識也不斷深入。據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，MiRNA-351作為一種重要的調(diào)控因子，在細(xì)胞凋亡、增殖、分化等生理過程中均起著重要參與作用。為進(jìn)一步探究MiRNA-351在卵泡發(fā)育中的調(diào)控作用，本研究特以小鼠模型為對象開展實(shí)驗(yàn)探究，旨在為卵泡發(fā)育機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料

選取60只雌性小白鼠作為研究對象，均購自南京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，品系為C57 black 6，批號為000659。室溫條件下，12h光照、12h黑暗下飼養(yǎng)，自由采食和飲水，并嚴(yán)格控制溫度、濕度、光照條件。入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）健康雌性白鼠；（2）經(jīng)我院實(shí)驗(yàn)動物倫理審查。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）未足月分娩幼鼠；（2）卵巢先天畸形，或發(fā)育異常。

1.2方法

1.2.1所有幼鼠均注射PMSG和HCG，劑量均為10IU，并于出生后第5、7、11、14天和第20天處死（每次處死12只），在顯微鏡下分離出小腔前卵泡（直徑100～130μm），大腔前卵泡（直徑200～280μm），有腔卵泡（直徑450～550μm）和成熟卵泡（直徑500～600μm），各15只。

儀器：切片機(jī)（德國Leica RM2135型）；移液器（美國Thermo Finnpipette型）；顯微鏡（日本Nikon 80i型）；微波爐（中國GalanzP7021TP-6型）；恒溫箱（中國福馬GHX-9270B-1型）；恒溫冰箱（中國榮事達(dá)BCD-245F）。

1.2.2主要試劑和設(shè)備（1）試劑：異丙醇、無水乙醇、β-強(qiáng)基乙醇、氯仿、氯化鉀、磷酸氫二鈉等均從我院實(shí)驗(yàn)室領(lǐng)??；a-MEM培養(yǎng)液、胎牛血清、雙抗、胰酶等均購自美國Gibco公司、mRNA分離試劑盒購自美國Qiagen公司；（2）細(xì)胞培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板購自美國康寧公司，恒溫水浴鍋（杭州朗越儀器HH-501型）、酶標(biāo)儀（北京普朗新9602A型）、高壓滅菌鍋（濟(jì)南展康BKQP-75L型）、工作臺由我院實(shí)驗(yàn)室提供、離心機(jī)（德國HERML Eppendorf 5418型）、電泳儀（美國Bio-rad 164-5070型）、超低溫冰箱（中國榮事達(dá)BCD-245F）、培養(yǎng)箱（中國福馬GHX-9270B-1型）、熒光顯微鏡（日本Nikon 80i型）等；（3）緩沖液配置：PBS、細(xì)胞培養(yǎng)液、卵泡成熟培養(yǎng)液以及卵泡分離液等均參照《現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)動物學(xué)技術(shù)》中相關(guān)方法配置。

1.2.3實(shí)驗(yàn)方法參照《現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)動物學(xué)技術(shù)》依次行引物設(shè)計(jì)、卵泡MiRNA提取、顆粒細(xì)胞分離和體外培養(yǎng)、顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染MiRNA、顆粒細(xì)胞凋亡和增殖水平檢測等，（1）引物設(shè)計(jì)（由大連寶生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成）；（2）卵泡MiRNA提?。菏紫刃袠悠诽幚恚缓蟛捎肞BS緩沖液行裂解處理，將已反轉(zhuǎn)錄好的模板行RT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序：95℃條件下預(yù)變性（時間為5min）、95℃條件下變性（時間為10s），60℃條件下退火（時間為30s），共進(jìn)行40個循環(huán)后持續(xù)緩慢升溫至95℃，自然冷卻。結(jié)果分析：利用擴(kuò)增倍數(shù)公式，重復(fù)三次計(jì)算樣品中MiRNA-351表達(dá)量；（3）顆粒細(xì)胞分離和體外培養(yǎng)：使用胰酶、培養(yǎng)液等進(jìn)行顆粒細(xì)胞分離、體外培養(yǎng)和傳代；（4）顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染MiRNA：轉(zhuǎn)染前應(yīng)首先行接種處理，然后將細(xì)胞置于培養(yǎng)基孔中，搖勻后在培養(yǎng)箱中37℃條件下孵育，注意需要每隔4～6h更換一次培養(yǎng)基；（5）顆粒細(xì)胞凋亡和增殖水平檢測：分別采用流式細(xì)胞儀和酶標(biāo)儀對上述轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行凋亡和增殖水平檢測，檢測前需要將顆粒細(xì)胞進(jìn)行PBS緩沖液沖洗，離心分離。

1.3觀察指標(biāo)

觀察不同卵泡發(fā)育階段MiRNA-315表達(dá)水平，共分為小腔前卵泡、大腔前卵泡、有腔卵泡和成熟卵泡等；對比MiRNA-315對顆粒細(xì)胞凋亡和增殖水平的影響。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0國際專用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，表達(dá)水平、增殖效能等計(jì)量資料均用（x±s）的形式描述，多樣本比較用方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)。當(dāng)P<0.05時，認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1不同卵泡發(fā)育階段MiRNA-315表達(dá)

不同卵泡發(fā)育階段MiRNA-315表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中以大腔前卵泡MiRNA-315表達(dá)水平最高，小腔前卵泡、有腔卵泡次之、成熟卵泡最低，詳情見表1。

2.2MiRNA-315對顆粒細(xì)胞凋亡水平的影響

不同卵泡發(fā)育階段顆粒細(xì)胞凋亡水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中有腔卵泡凋亡水平最高、小腔前和成熟卵泡次之、大腔前卵泡最低，詳情見表2。

2.3MiRNA-315對顆粒細(xì)胞增殖水平的影響

和Mimics-351組增殖效能相比較，Inhibitor-351水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)降低，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），詳情見表3。

3討論

雌性哺乳動物剛出生時卵巢內(nèi)便存在有大量的卵泡，此類原始卵泡將會隨著時間的延長和卵泡池的建立逐漸開始啟動生長、凋亡等一系列生理過程。原始卵泡同時也會隨著時間的延長和年齡的增長不斷消亡耗竭，只有極少數(shù)能夠發(fā)育至成熟。而另外巨大部分卵泡由于GCs的凋亡在發(fā)育過程中出現(xiàn)閉鎖。GCs凋亡在卵泡發(fā)育過程中的調(diào)控作用已在小鼠模型中得到驗(yàn)證，并且隨著研究不斷深入，相關(guān)抗凋亡因子和促凋亡因子及其作用也逐漸被挖掘明確。其中MiRNAs在不同出生天數(shù)，即不同卵巢發(fā)育程度時間表達(dá)譜中顯示顯著差異，并且在其它動物體外實(shí)驗(yàn)研究中得到證實(shí)。MiRNA-351作為其中較為重要的一份子，在小鼠卵泡發(fā)育過程中具有顯著作用。

MiRNA-351具有多重功能，在前脂肪細(xì)胞及干細(xì)胞增殖、分化、凋亡及激素分泌調(diào)節(jié)中均具有顯著作用。該因子水平過度表達(dá)將會導(dǎo)致相應(yīng)細(xì)胞局部形態(tài)學(xué)方面變化，并且在卵巢卵泡細(xì)胞分化、轉(zhuǎn)錄和調(diào)控作用中均有參與。據(jù)國外相關(guān)研究資料表明，將小鼠中的MiRNA-351基因敲除，將會使得卵泡細(xì)胞增殖受抑，并且在分化向凋亡轉(zhuǎn)換進(jìn)程將會被明顯縮短，且在MiRNA過表達(dá)小鼠卵巢中發(fā)現(xiàn)卵泡細(xì)胞發(fā)育進(jìn)程也同樣發(fā)生異常，在凋亡和增殖分化過程中也同樣涉及MiRNA表達(dá)及調(diào)控作用。此外，MiRNA-351表達(dá)由于在小鼠卵泡發(fā)育過程中作用不同，故而其表達(dá)水平和調(diào)控機(jī)制也不相同，在特定階段可能對復(fù)雜基因均有調(diào)控作用，從而影響其卵泡凋亡和增殖水平。MiRNA-351在不同生理發(fā)育過程和特定時間內(nèi)才會表達(dá)，并參與復(fù)雜基因調(diào)控機(jī)制，從而促進(jìn)卵泡生長發(fā)育。Mimics-351屬于一種模擬酶，可通過抑制相關(guān)基因表達(dá)對卵泡細(xì)胞生長產(chǎn)生負(fù)向調(diào)控作用，同時還可抑制其增殖和生長，推測該因子可能通過降解相關(guān)基因mRNA以調(diào)控卵泡細(xì)胞發(fā)育狀態(tài)；而Inhibitor-351為MiRNA-351基因受體，主要通過翻譯抑制和蛋白質(zhì)調(diào)控途徑發(fā)揮作用，從而控制卵泡發(fā)育和閉鎖平衡。當(dāng)前，關(guān)于MiRNA-351對小鼠卵泡發(fā)育中調(diào)控作用機(jī)制認(rèn)識尚不夠深入，但是對于Mimics-351和Inhibitor-351二者在卵泡發(fā)育中異常表達(dá)已得到一致肯定，將為雌性動物卵巢中卵泡生長機(jī)制發(fā)育和病理改變研究提供奠定基石。

本研究結(jié)果中，不同卵泡發(fā)育程度MiRNA-315表達(dá)水平存在顯著差異，且MiRNA-315對顆粒細(xì)胞凋亡和增殖水平的影響也顯而易見，推測該因子表達(dá)水平和小鼠卵泡發(fā)育程度、細(xì)胞增殖和凋亡作用及機(jī)制均有顯著調(diào)控作用。綜上，MiRNA-315可能參與小鼠卵泡發(fā)育過程內(nèi)在調(diào)控，在一系列生理改變過程中均有明顯作用。但是本研究仍存在不足：目前Mimics-351和Inhibitor-351具體作用機(jī)制尚不明確，且MiRNA-315和卵巢卵泡細(xì)胞病理改變臨床關(guān)系仍需要進(jìn)一步研究探索，而隨著分子生物學(xué)發(fā)展不斷深入，上述問題將會成為今后研究重點(diǎn)和發(fā)展方向。