水產降解菌篩選一般方法及可能存在的問題

楊移斌 艾曉輝

水產降解菌篩選一般方法及可能存在的問題

楊移斌 艾曉輝

隨著社會經濟的不斷發展，人們生活水平不斷提高，人們對食品、環境等安全意識不斷提高。因此在水產養殖中應用有益微生物替代化學藥物的呼聲高漲，同時也引起了廣大科研及養殖工作者積極回應。目前水產中微生態制劑主要分為三大類：①水質改良類。主要用于水質調節，養殖池底改良，有毒有害物質分解，抑制有害藻類或促進有益藻類生長等。②病原拮抗類。主要用于抑制水產病原的生長繁殖，預防病害的暴發。③促魚類生長及免疫增強類。主要功能是促進魚類生長，增強魚類抵抗力，調節腸道健康。隨著微生態制劑在水產養殖中應用范圍不斷擴大，快速篩選有效安全的益生菌株成為了研究的熱點。本文就常用微生態制劑中水質改良類之一的降解菌篩選方法做一個探討，并分析本人認為可能存在的一些問題，以期與水產同行交流，更好地促進降解菌在水產中的應用。

1 降解菌篩選一般方法

1.1 富集培養

在錐形瓶中加入100mL蒸餾水，121℃滅菌。無菌條件下取10g可能含有降解菌的樣品于上述培養基中，于30℃、180rpm震蕩培養3天。

1.2 馴化培養

在錐形瓶中加入基礎鹽培養基100mL，121℃滅菌后，加入0.5mL已過濾的目標降解物標準液，使目標降解物的終濃度為50mg/L。在無菌條件下取土壤培養液的上清液，于30℃、180rpm震蕩培養5天。5天后按10%的接種量取培養液上清液，接入到目標降解物濃度為100mg/L新鮮的基礎鹽培養基中，同法培養5天。逐次提高目標降解物的濃度，每次提高50mg/ L，使基礎鹽培養基中目標降解物終濃度為300mg/L。

1.3 分離純化

從最后一次馴化培養液涂布得到的平板挑取單菌落，進行劃線純化，得到單菌落后再挑取單菌落進行劃線，對在培養基上生長良好、傳代穩定的不同菌株進行編號后，于4℃冰箱保存，以進行下一步降解能力的測定。

1.4 菌株降解能力測定

從平板上挑取單菌落，接種于LB液體培養基中，于30℃、180rpm搖床培養48h，4000rpm離心10min收集菌體，用0.02M磷酸鹽緩沖液洗滌2次，再用相同緩沖液制成菌體懸獨液作為種子液。以10%的接種量，將種子液接種到含有100mg/L目標降解物的基礎鹽培養基中，于30℃、180rpm搖床培養5d，以不接菌的目標降解物培養液為空白，每24h取樣測OD600，5d后經色譜法測定菌株對目標降解物的降解率。

1.5 菌株的鑒定

對分離得到的菌株培養至對數生長期進行形態觀察、電鏡觀察、生理生化實驗，在此基礎上進行16S rDNA基因序列分析。其中生理生化實驗包括：革蘭氏染色實驗、葡萄糖發酵實驗、淀粉水解實驗、氧化酶實驗、接觸酶實驗、甲基紅實驗。

2 存在的問題

通過上述試驗一般可以分離到相應的菌株，但其在驗證效果時卻發現不理想，最后鑒定的結果一般都是芽孢類菌株。導致這種結果的原因為富集培養時可能存在的降解菌并沒有很好地生長繁殖，數量也沒有明顯的增加，芽孢等卻迅速增長，而在馴化培養時加入目標降解物，因為環境等惡劣變化，降解菌此時也不太可能迅速生長繁殖，而芽孢等卻可以通過孢子的形式存活下來，故在分離時芽孢等的數量反而占優勢。這也解釋了現階段為何芽孢類的產品居多，因為其存活能力很強。我們通過如此強烈針對性方法去篩選，最后卻很可能在驗證降解能力時得到一次次失敗的結果，這個方法很可能是我們科研工作者的一廂情愿。

3 建議

筆者建議在進行降解菌篩選時不要走捷徑，與其花費很多時間與精力去尋找方法，不如踏踏實實地使用最原始的方法，即采取先將可能含有降解菌的樣品稀釋涂布于不同培養基上，28℃恒溫培養24h后，得到多種菌株純培養物，再進行菌株降解能力驗證。本方法雖笨拙、工作量大，但卻穩步向前，反而易達到目的，獲得相應的降解菌株。

（通聯：430223，中國水產科學研究院長江水產研究所 電話：17771809619）