水產動物病原藥物敏感性實驗技術

楊移斌 艾曉輝 宋 懌

水產動物病原藥物敏感性實驗技術

楊移斌1，2艾曉輝1，2宋 懌2，1

隨著水產養殖業的迅猛發展，高密度、集約化養殖雖然帶來了水產品產量的不斷攀升，但是同時也使得水產養殖動物的生存環境日漸惡化，從而導致各類疾病頻發。病害發生導致重大經濟損失的原因常常是沒有做到準確診斷，沒有做到對病用藥，通常是憑經驗進行診斷用藥。因此有必要提高水產一線從業者進行病原分離，開展藥物敏感性實驗的意識，以做到準確診斷魚病，對病用藥。本文將就藥物敏感性實驗進行介紹及改良，從而更好地供同行參考及應用好藥物敏感性實驗。

1 藥物敏感性實驗使用范圍

藥物敏感性實驗（簡稱藥敏實驗，）涉及到病原及藥物兩方面，因此病原必須是可體外培養的，可分離的，而藥物目前常用抗生素都有市售藥敏紙片供選擇，而針對其他藥物如消毒劑等，則可進行相應的MIC/MBC測定，從而評估病原對其敏感性。目前可以進行藥敏實驗的病原只有細菌、真菌以及一些寄生蟲（寄生蟲的藥敏實驗主要以活蟲體在藥物刺激下掙扎程度來反應的）。

2 藥物敏感性實驗操作

目前藥敏實驗主要分為瓊脂擴散法（即K-B法）及倍比稀釋法，而瓊脂擴散法又分為打孔法及藥敏紙片法。一般以藥敏紙片法及倍比稀釋法最常用。

無菌條件下，取患瀕死水產養殖動物，取病灶及重要組織器官如肝腎脾等，用接種環蘸取所取各樣品在固體培養基上劃線，置于28℃恒溫培養箱中培養24h。從已經長好菌落的平板上挑取形態大小、顏色相近的菌落進一步純化培養。向分離得到的純化菌株加入25%甘油，混勻后于-80℃冷凍保存。

藥敏紙片法：將分離株接種于液體培養基中，經200r/min恒溫28℃震蕩培養18h，用無菌生理鹽水調整分離株濃度為104-108CFU/mL，取100μL菌液均勻涂布于固體瓊脂培養基上，貼上不同種類的藥敏紙片，28℃恒溫培養24h后測量抑菌直徑，根據藥敏紙片說明書或者其他標準判定分離株對不同藥物的敏感性。

倍比稀釋法：主要是通過使用液體培養基倍比稀釋藥物，然后在每個濃度藥物內接種病原，恒溫培養24h后，把無菌生長、稀釋度最大的藥物如消毒劑濃度作為分離株的MIC，取所有無菌生長的組涂布于固體培養基上，恒溫培養24h后觀察有無菌落生長，平板上無菌落生長的最低藥物如消毒劑濃度即為MBC。

3 實際生產中可選用的藥敏實驗方法

在實際生產中由于條件限制以及病情的緊迫性，使得藥敏實驗不太可能像在實驗室這么開展，因此制定生產中藥敏實驗方法顯得更加迫切，下面就生產中可行的藥敏實驗方法進行詳細闡述。

首先針對發病水產養殖動物進行取樣，同樣是選擇具有典型癥狀瀕死的個體。在無菌條件下，取其病灶部位及重要組織器官。將所取樣品分別剪碎，溶解于無菌0.9%生理鹽水中，后涂布于固體平板上，或者接種含有不同濃度藥物試管中，其后操作同上，經恒溫24h培養后即可讀取結果。

4 小結

本文就傳統藥敏實驗意義、適用范圍及操作步驟進行了相關闡述，可以使水產一線從業者更好地認識及理解藥敏實驗，也是為其重視、甚至是踐行藥敏實驗提供良好的技術材料。對藥敏實驗技術進行改良的意義在于第一節省了寶貴的時間，直接把病樣碾碎，溶解于生理鹽水中，伴隨著把病原也溶于其中，從而不再需要純化培養細菌，可節省近三天的時間；第二在于提高了藥敏實驗的準確性，在現今各種病害頻發的年代，單一病原引發病害早已成為過去時，現在多是多種病原多重感染引發的，如黃顙魚腹水病、中華鱉腐皮病等，筆者從事水生動物病害臨床診斷多年，深有感觸，好不容易將病樣中微生物純化分離出來，一看傻眼了，各種微生物呈現在眼前，而感染卻很少有成功的，多次重復都很難奏效，用此種病純化出來的微生物進行藥敏實驗，其效果就可想而知了，本方法采用不純化病原，即使病原多樣，涂布于或者接種于液體培養基上，微生物都可生長，而藥物對其抑制或者殺滅，都是同步反應出來的，因此可以顯著提高藥敏實驗效果。綜上，藥敏實驗需好好做，但更應該做好，為養殖戶謀福利，為水產養殖動物減輕痛苦。

（通聯：1.430223，湖北省武漢市東湖高新技術開發區武大園1路8號 中國水產科學研究院長江水產研究所 電話：17771809619；2.1001412，中國水產科學研究院，農業部水產品質量安全控制重點實驗室，北京）

現代農業產業技術體系建設專項（CARS-49）資助