橘子酒生香酵母的優選研究

陳清嬋，朱娜娜，孫愛紅

（荊楚理工學院生物工程學院，湖北荊門448000）

橘子酒生香酵母的優選研究

陳清嬋，朱娜娜，孫愛紅

（荊楚理工學院生物工程學院，湖北荊門448000）

通過對從橘子果實上分離篩選出的3株天然野生菌株和5株商業果酒酵母的發酵速度、發酵力、感官品質和氣相分析結果進行系統比較研究，從中篩選出適宜橘子酒釀造的優良生香酵母菌株JZ-3。發酵力為0.20 g/g·d，主發酵速度相對較低，到發酵后期的速度平緩，對于果酒香氣的形成和風味物質的積累十分有利,釀造出來的橘子酒品質最佳，酒體呈現出淺橘黃色，較為澄清透明，且酒體光澤度好，具有橘子清新的果香和純正、協調的酒香，具有典型性，酒的整體品質較高。

橘子酒；香氣；生香酵母

橘子酒是一種營養豐富的低酒精度果酒，風味品質是其重要的質量指標。正常果酒應該酒香醇厚，果香濃郁，具有典型性。但市場上的橘子酒卻呈現果香味淡薄、品質不高、典型性不足的現狀。酵母是影響果酒品質的重要因素，在橘子酒釀造中，缺乏專用生香酵母一直是影響橘子酒品質的重要原因。國內對獼猴桃果酒[1]及其他果酒生香酵母及其性能都做過研究[2-6]，但在柑橘果酒方面，國內研究多集中在釀造工藝[7-8]及選育適宜釀酒的酵母方面[9-13]，在橘子酒生香酵母方面研究比較少。

本實驗通過對從橘子果實上分離篩選出的天然野生優良菌株和優選的商業果酒酵母的釀造性能、所釀造橘子酒的感官品質和生香性能進行系統比較研究，從中篩選出生香能力強并且橘子香氣物質保留最好的優良酵母菌株，為進一步研究橘子酒專用生香酵母提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：橘子，荊門本地產；白砂糖，武漢廣盛元食品有限公司；陳釀紅葡萄酒專用酵母、白葡萄酒專用酵母、X16酵母、23 23酵母、安琪果酒酵母，煙臺帝伯仕自釀機有限公司。

主要試劑：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（分析純），Beijing Solarbio Science；亞硫酸（分析純），天津市東麗區天大化學試劑廠；無水硫酸鈉（分析純），天津市福晨化學試劑廠；二氯甲烷（分析純），天津市福晨化學試劑廠；丙酮（分析純），國藥試劑；無水乙醇（分析純），武漢市洪山中南北化工試劑有限公司。

儀器設備：JJ-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺，蘇州金凈科技儀器有限公司；LRH-150-S恒溫培養箱，天津市泰斯特儀器有限公司；YQL-100S11高壓滅菌鍋，上海博迅實業有限公司醫療設備；GL21M離心機，長沙湘智離心機儀器有限公司；ZHWY-200B恒溫搖床，上海智城分析儀器制造有限公司；GC-4000A氣相色譜儀，北京東西電子。

1.2 實驗方法

1.2.1 橘子酒野生酵母的分離純化

本實驗從橘子果實上分離純化野生釀酒酵母。挑選腐爛并帶有酒香味的橘子于無菌水中制得懸菌液，在28℃PDA培養基上進行平板培養3 d，觀察其菌落特征，分離出單個菌落，逐步進行分離純化。將適宜菌株轉移至試管斜面以28℃進行增殖培養，3 d后轉移到4℃冰箱中保藏備用，使用前用橘子清汁擴大培養24 h。

1.2.2 橘子酒釀造工藝

調糖：用白砂糖調整橘子汁糖度為20°Bx。

調SO2：用亞硫酸調整SO2濃度為100 mg/L。

橘子清汁：橘子剝皮、榨汁、過濾、調整可溶性固形物為20°Bx，加入亞硫酸調整SO2濃度為100 mg/L，獲得可直接使用的橘子清汁，冰箱低溫保存備用。

1.2.3 菌種活化

斜面酵母菌株的活化：用接種環取1環保存的斜面酵母轉接到PDA斜面培養基上，培養箱中28℃培養24～48 h，至酵母長滿斜面。

干酵母的活化：稱取0.02 g干酵母，置于調好的100 mL橘子清汁中于30℃水浴鍋中水浴活化15 min。

1.2.4 菌種擴大培養

從活化斜面培養基上取1環活化菌種接入50 mL經滅菌處理的橘子清汁中，28℃搖床培養24 h振蕩速度120 r/min。

1.2.5 各酵母菌株的發酵速度與發酵力比較

分別將各菌株擴大培養液按5%的體積比例接入到100 mL橘子清汁中，搖勻后25℃培養，于培養箱中恒溫發酵，每隔24 h稱重1次記錄CO2失重量，至相鄰2次失重之差小于0.1 g為發酵終點，終止發酵，將發酵液于4000 r/min離心10 min，收集各菌株發酵后的菌泥，并稱重，按公式計算各菌株的酵母發酵力，同時繪制橘子汁發酵液失重與發酵時間曲線，比較各酵母菌株發酵速度的快慢。

單位酵母發酵力（g/g·d）=CO2失重量/菌泥重×發酵時間。

1.2.6 各菌株釀造橘子酒感官評定

參照葡萄酒評比標準（OIV公布）結合葡萄酒果酒通用分析方法（GB/T 15038—2006）由5名人員(男女比例3∶2)對各菌株釀造橘子酒進行感官評定，評定指標及分值見表1。

1.2.7 各菌株釀造橘子酒香氣比較

1.2.7.1 二氯甲烷萃取香氣物質

取離心后的樣品50mL，分別用20mL、20mL和10mL的二氯甲烷連續萃取3次。萃取的香氣物質，用3 g無水硫酸鈉干燥24 h，第2天將干燥好的樣品進行過濾，注意要保證樣品中不能有水分，將樣品裝入1 mL的棕色瓶中，作為樣品進行檢測。

1.2.7.2 氣相分析檢測

GC條件：DB-Wax色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25μm）；程序升溫為初溫40℃，保留5 min，然后以2℃/min升溫至60℃，再以3℃/min升溫至230℃保留5 min，設置氣化室A溫度為250℃，氫焰為150℃，溫度達到標準后，點火，30 min后待基線平穩，用進樣器取1μL樣品迅速打入機器中，待樣品充分揮發后，統計出峰結果。

1.2.7.3 氣相分析數據分析統計

分析統計橘子清汁及各酵母所釀橘子酒香氣物質數量，以歸一化計算各香氣物質的峰面積，作為各香氣成分的相對含量。根據香氣物質種類數及含量比較各菌株的生香性能。

2 結果與分析

2.1 橘子酒酵母的分離、純化

經富集培養以及反復分離、純化操作，得符合酵母特征的酵母菌3株，命名為JZ-1、JZ-2、JZ-3。通過觀察,其菌落、菌體特征分別見圖1—圖3。

從圖1可知，JZ-1酵母菌落呈乳白色，圓形，邊緣無絨毛，大而厚，有一定凸起度，表面有光澤且黏稠，易挑起，菌落質地均勻，正反面和邊緣、中央部位顏色都很均一。

從圖2可知，JZ-2酵母菌落呈微黃色近透明小菌落，圓形，邊緣光滑，略微凸起，表面有光澤黏稠，易挑起，均一性良好。

從圖3可知，JZ-3酵母菌落呈微黃色小菌落，數量多，橢圓形，邊緣有小絨毛，略微凸起，表面有光澤黏稠，易挑起。

2.2 各菌株發酵力比較

通過對野生分離的3株酵母菌株和商用5株果酒酵母在橘子清汁中發酵過程中5 d內CO2的總失重量及各菌株的總菌泥重，通過公式計算比較8株酵母菌的單位酵母發酵力，結果見表2。

由表2可知，安琪酵母、JZ-1、紅葡萄酒專用酵母、白葡萄酒專用酵母等發酵力明顯高于其他4株酵母，均達到了0.37 g/g·d以上，安琪酵母甚至達到了0.43 g/g·d，而JZ-2、JZ-3、23 23等酵母的發酵力都比較低，分別為0.19 g/g·d、0.20 g/g·d、0.16 g/g·d。發酵力越低，發酵速度相對越平穩，對果酒香氣的形成和風味物質的積累越有利，而發酵力高的酵母，其發酵速度快，酒的風味相對較烈不夠協調柔和。單位酵母發酵力相對越低，更有利于提高橘子酒整體質量。因此JZ-2、JZ-3、23 23酵母更適于作為優選生香酵母菌株。

2.3 各菌株發酵速度比較

通過對野生分離的3株酵母菌株和商用5株果酒酵母在橘子清汁發酵過程中5 d內CO2的失重量統計，繪制CO2失重量隨發酵時間的變化曲線，即8株酵母菌株的發酵速度曲線，結果見表3。

由表3可知，8種菌株發酵速度呈3種不同趨勢。紅葡萄酒釀酒酵母、X16、23 23這3株酵母起酵速度最快，主發酵速度較快，發酵延滯期短；JZ-1、安琪酵母、白葡萄酒專用釀酒酵母等3株酵母發酵速度先降后升，并且主發酵速度最快，但延滯期最短，到達最高發酵速度后立刻下降；JZ-2、JZ-3菌株啟發速度較慢且平緩，延滯期最長。發酵速度快，酒的風味相對較烈不夠協調柔和。主發酵速度相對較慢，到發酵后期的速度更為平緩，對于果酒香氣的形成和風味物質的積累十分有利，可提高橘子酒品質。因此，JZ-2、JZ-3菌株更適于作為優選菌株。

2.4 各菌株釀造橘子酒感官品質比較

由表4可知，菌株JZ-3所釀橘子酒的外觀、滋味、香氣和典型性都比較好，綜合得分排在第一位。JZ-1、安琪、23 23所釀橘子酒外觀、香氣都不理想。陳釀紅葡萄酒專用酵母所釀橘子酒典型性差，橘子原來香氣保留太少，白葡萄酒專用酵母所釀橘子酒酒香果香單薄,典型性差，X16、23 23所釀橘子酒香氣略勝于白葡萄酒和紅葡萄酒專用酵母，但外觀較前者差，典型性同樣比較差。安琪整體品質居中，但遠遠遜色于菌種JZ-3所釀橘子酒。陳釀紅葡萄酒專用酵母、白葡萄酒專用酵母、X16、23 23等所釀橘子酒略帶苦澀辛酸氣味，整體雜味比較多，口感差。通過比較可知，菌株JZ-3的釀造性能顯著優于其他酵母菌株，釀造的橘子酒外觀好，酒體呈現出淺橘黃色，較為澄清透明，且酒體光澤度好；酒體較豐滿、醇厚爽口；香氣特征為具有橘子清新的果香和純正、協調的酒香，能很好體現橘子酒的典型性，酒的整體品質較高。

2.5 各菌株釀造橘子酒香氣比較（表5、表6）

由表5可知，通過氣相色譜法分析檢測，橘子清汁含氣味物質22種，但相對含量都比較低；陳釀紅葡萄酒專用酵母、白葡萄酒專用酵母所釀橘子酒氣味物質種類最多，分別為30種、40種；JZ-1、23 23等酵母所釀橘子酒氣味物質種類最少，分別為12種、19種，甚至低于橘子清汁氣味物質種類；并非所有氣味物質都有利于橘子酒香氣形成，由于儀器設備限制不能檢測出氣味物質具體成分，故通過對氣相分析所得數據分析統計得到各菌株所釀橘子酒橘子清汁香氣物質保留數量。

由表6可知，JZ-3酵母菌株保留橘子清汁香氣物質10種，總含量5.7642%，是8株酵母中保留種類最多、含量最大的一種；安琪酵母適用于大部分果酒釀造，所以在橘子清汁香氣物質保留數量和含量方面都僅次于JZ-3酵母菌株，居第二位；JZ-1、X16、23 23等酵母菌株橘子清汁香氣物質保留最少。因此，JZ-3酵母菌株發酵橘子酒，橘子果味典型性最好，這與感官評定的結果相符。

3 結論

在8株釀酒酵母中，JZ-3菌株菌落呈白色，圓形，較厚，有一定的凸起，邊緣略微鋸齒狀，表面有光澤且有彈性，易挑起。發酵力為0.20 g/g·d，主發酵速度相對較低，到發酵后期的速度平緩，對于果酒香氣的形成和風味物質的積累十分有利,氣相分析得JZ-3菌株所釀橘子酒含香氣物質22種，保留橘子清汁香氣物質10種，含量為5.7642%。感官評價得分87.8分，釀造出來的橘子酒品質最佳，酒體呈現出淺橘黃色，較為澄清透明，且酒體光澤度好，酒體較豐滿、醇厚爽口，香氣特征具有橘子清新的果香和純正、協調的酒香，具有典型性，酒的整體品質較高。

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Screening of Aroma-Producing Yeast Strains for Orange Wine

CHEN Qingchan,ZHU Nana and SUNAihong
(College of Bioengineering,Jingchu University of Technology,Jingmen,Hubei 448000,China)

The fermenting rate,fermenting power,sensory quality,and GC analytic results of 3 wild yeast strains isolated from orange fruit and 5 commercially-available fruit wine yeast strains were compared.Finally,yeast strain JZ-3,suitable for orange wine production,was screened out.Its fermenting power was 0.20 g/g.d,and its fermenting rate was comparatively low in chief fermentation period and was stable in late fermenting period,which was beneficial to the formation of wine aroma and the accumulation of flavoring substances in wine.The wine produced by strain JZ-3 was pale orange yellow in color,clear and transparent with good gloss.Besides,the wine had pure orange aroma and harmonious taste and its overall quality was high.

orange wine;aroma;aroma-producing yeast

TS262.7；TS261.1；TS261.4

A

1001-9286（2017）03-0065-04

10.13746/j.njkj.2016367

湖北省教育廳科學研究計劃資助項目（Q20154304）。

2016-12-09

陳清嬋（1983-），女，講師，博士，研究方向為風味食品，E-mail：xiaochan434@hotmail.com。

優先數字出版時間：2017-02-13；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170213.0943.001.html。