馬齒莧黃酮提取工藝及其分離純化和抑菌作用分析

●鄭楚萍陳法江陶濤

馬齒莧黃酮提取工藝及其分離純化和抑菌作用分析

●鄭楚萍1陳法江2陶濤3

目的：探究馬齒莧黃酮提取工藝的條件及對(duì)其抑菌作用的研究。方法：馬齒莧黃酮提取的過(guò)程大致為：首先采用超聲波法粗提馬齒莧黃酮液，再采用正交試驗(yàn)對(duì)粗提液進(jìn)行優(yōu)化，最后經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂對(duì)優(yōu)化液進(jìn)行純化，再通過(guò)紙片擴(kuò)散法對(duì)純化后的黃酮進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。結(jié)果：我們研究得出在料液比為1:25、溫度50℃、時(shí)間40m in、功率200W是馬齒莧黃酮最佳的提取條件，在此條件下，黃酮的得率為3.6%。抑制強(qiáng)弱順序?yàn)椋航湍妇竞谇梗敬姿峋敬竽c桿菌。

馬齒莧；黃酮；提取與純化；抑菌活性

馬齒莧使用常見(jiàn)的中草藥，也是大眾喜歡的野生蔬菜，隨著對(duì)馬齒莧的不斷深入了解，馬齒莧已經(jīng)公認(rèn)的為“藥食同源”的植物，所以無(wú)論從保健上還是從食用上來(lái)看，馬齒莧都是一種不可多得的藥品及食物。根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)表明馬齒莧對(duì)痢疾桿菌具有殺菌作用，其煎服對(duì)大腸桿菌也有一定的療效，其提取液對(duì)某些真菌也具有一定的抑制效果，而本文的主要分析是對(duì)其提取、純化馬齒莧黃酮的工藝條件并對(duì)其抑菌作用進(jìn)行初步研究。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 馬齒莧

在廣州某藥店購(gòu)買(mǎi)；大孔吸附樹(shù)脂：由東鴻化工有限公司提供；其他試劑均由廣州醫(yī)科大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 馬齒莧中黃酮的提取和測(cè)定

取適量馬齒莧物品，放于圓底燒瓶中，并去除其中夾雜的脂肪雜質(zhì)，然后將抽提液冷卻過(guò)濾，將上層液體棄去，放置于低溫干燥箱中烘干，備用。黃酮的含量通過(guò)比色法測(cè)定[1]，溶液的吸光值用分光光度計(jì)在510nm處測(cè)定。

1.3 馬齒莧黃酮提取單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)

對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、溫度、時(shí)間和超聲功率進(jìn)行單因素試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定正交試驗(yàn)的工藝參數(shù)，選擇四因素三水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，經(jīng)方差分析確定馬齒莧黃酮提取的最佳工藝條件。

1.4 馬齒莧中提取液的純化

將濃度為0.5g/m L的黃酮提取液上層放在預(yù)先處理好的大孔樹(shù)脂(pH為中性)層析柱中，控制流速為0.5m L/m in，達(dá)到飽和后用70%的乙醇作為洗脫劑以2m L/min的流速進(jìn)行洗脫，自動(dòng)收集器收集洗脫液。

1.5 黃酮的抑菌活性

黃酮的抑菌活性的測(cè)定采用紙片擴(kuò)散分析方法。大腸桿菌、醋酸菌、酵母菌和黑曲霉用作指示細(xì)菌并接種于平板上。無(wú)菌濾紙片于黃酮溶液(5mg/m L)中浸濕，取出，置于平板上。以生理鹽水作為對(duì)照。培養(yǎng)箱培養(yǎng)后，對(duì)抑菌區(qū)進(jìn)行觀察測(cè)定。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS21.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，其中計(jì)數(shù)資料采用卡方驗(yàn)，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05為差異顯著有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 超聲波輔助法馬齒莧黃酮的單因素分析

（1）乙醇濃度對(duì)馬齒莧提取的影響：在本次研究中采用的為70%的無(wú)水乙醇為溶劑，在溫度、時(shí)間等條件不變情況在分別采用不同濃度的乙醇后，發(fā)現(xiàn)隨著濃度的增加馬齒莧提取效果呈現(xiàn)一個(gè)先上升后下降的趨勢(shì)，提取效果在乙醇濃度為70%附近效果最好。（2）溫度對(duì)馬齒莧提取的影響：當(dāng)固定其他條件，而溫度作為變量時(shí)發(fā)現(xiàn)，在不同的溫度下，開(kāi)始隨著的溫度的升高馬齒莧的提取液效果也升高，在大約60℃左右時(shí)隨著溫度的升高，提取濃度將不再變化。（3）提取時(shí)間對(duì)馬齒莧提取效果的影響：固定其他條件，將提取時(shí)間作為變量時(shí)發(fā)現(xiàn)，同乙醇濃度對(duì)馬齒莧的影響相同，隨著時(shí)間的變化，呈單峰形式，在大約40m in左右時(shí)達(dá)到峰值。（4）料液比對(duì)馬齒莧黃酮提取的影響：料液比對(duì)馬齒莧提取的影響與溫度的影響大致相同，在1:25處提取達(dá)到最佳狀態(tài)。（5）功率的影響：固定其他條件，而功率作為變量時(shí)，功率對(duì)馬齒莧黃酮提取的影響也是一個(gè)單峰改變，并且在200W處為最佳提取功率。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

選取料液比、溫度、時(shí)間、功率進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)，確定最佳條件，最終發(fā)現(xiàn)四個(gè)因素中對(duì)馬齒莧黃酮體影響最大的因素就是功率，并且在料液比1:25，溫度50℃、40m in、200W處提取的效果最佳。

2.3 提純

提取的粗黃酮經(jīng)干燥后，使用大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)一步純化，得出采用70%的無(wú)水乙醇將黃酮洗出來(lái)后在采用蒸餾水洗，洗出來(lái)的曲線呈單一峰。

2.4 抑菌結(jié)果的對(duì)比

馬齒莧分別對(duì)酵母菌、黑曲霉、醋酸菌、大腸桿菌進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)馬齒莧對(duì)酵母菌抑菌較大、其次為黑曲霉、最后為大腸桿菌。

3 討論

大量研究表明，馬齒莧具有各種生物學(xué)效應(yīng)，主要包括骨骼肌松弛作用，鎮(zhèn)痛和抗炎性作用，抗真菌活性和抗生育作用。黃酮是一大類化合物的總稱，經(jīng)過(guò)研究其具有豐富的生物和藥理活性，如能夠抗細(xì)菌、抗真菌、抗螨蟲(chóng)、抗高血壓活性、消炎和抗病毒，隨著對(duì)黃酮結(jié)構(gòu)深入的研究，這類天然產(chǎn)物正逐漸地成為抗菌研究的主題。馬齒莧黃酮研究的熱點(diǎn)引起了化學(xué)家和免疫生物學(xué)家的重視，尤其是對(duì)免疫調(diào)節(jié)和抗病毒特性。同時(shí)，它們的抗菌活性也值得進(jìn)一步研究。

在本次研究中發(fā)現(xiàn)對(duì)馬齒莧黃酮提取最有利的條件為1:25、溫度50℃、時(shí)間40min、功率200W是馬齒莧黃酮最佳的提取條件。在此條件下，黃酮的得率為3.61%，在孫希云[2]的報(bào)道中采用無(wú)水乙醇對(duì)馬齒莧進(jìn)行分離純化，最終得到的濃度為3.52%，這與本文的結(jié)論大致相同，但是張?zhí)亓3]采用與孫希云相同的條件、過(guò)程提取的黃酮僅為0.63%，這種顯著性差異是可能是由于馬齒莧的不通過(guò)引起的。在本次研究中的抑菌強(qiáng)弱順序?yàn)椋航湍妇竞谇梗敬姿峋敬竽c桿菌。結(jié)果對(duì)馬齒莧黃酮的綜合利用和抑菌機(jī)制的研究都具有重要意義。基于這些結(jié)果，可以看出馬齒莧黃酮在食物腐敗、食物中毒的預(yù)防和治療方面能夠發(fā)揮顯著的作用。

（作者單位：1廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院；2廣州醫(yī)科大學(xué)研究生院；3廣州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院）

[1]王英豪,魏國(guó)強(qiáng),張理平.馬齒莧黃酮含量測(cè)定方法的建立[J].福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2012,22(2):44-46.

[2]孫希云,牛廣財(cái),孟憲軍,等.馬齒莧中黃酮類化合物的最佳提取工藝.食品與發(fā)酵工業(yè),2004,30(11):135-137.

[3]張?zhí)亓?于春月.馬齒莧中總黃酮的提取工藝研究.黑龍家醫(yī)藥科學(xué),2013,36(4):37-38.

鄭楚萍（1990～），女，碩士研究生，實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)樗幬锘瘜W(xué)研究。