免疫組化穩定表達與精細操作

●侯君

免疫組化穩定表達與精細操作

●侯君

若想要使免疫組化實現穩定表達，需要將免疫組化染色工作做好。進行免疫組化染色需要擁有綜合性的染色技術，在進行染色過程中多種因素會對染色工作造成影響，所以對免疫組化染色工作質量加以管理并提高染色工作的可信性顯得非常重要。我國醫療事業單位對免疫組化染色工作開展從21世紀初開始，經過十余年的發展，對免疫組化染色工作中的精細操作已經有了非常大的進步，本文就將對精細操作模式下染色工作質量控制各項內容，進行陳述。

免疫組化;精細操作;質量管理

免疫組化穩定表達是依靠免疫學中的抗原體反應原理，并通過化學反應使對組織細胞進行定位的顯色劑顯色，以此達到對組織細胞定性以及定量研究目的。因為這項操作處于細胞層次，所以若想要使免疫組化染色工作能夠實現穩定表達，就需要對染色過程中的各步驟進行精細化操作。下文就將對精細化操作的各項內容進行論述。

1 固定標本

進行染色標本固定時，需要在標本離體之后立即進行，固定液為10毫升甲醛加上90毫升PBS緩沖液所構成濃度為4%的中性緩沖甲醛，固定液的用量要達到固定標本體積的6倍。進行標本固定時，無論是固定時間過長或過短，還是固定不穩固都會導致標本抗原失去，因此在進行固定時要做到及時且穩固。固定的時間小標本不能小于六個小時，腫瘤標本則是不能低于24小時。此外，進行淋巴結及根治標本的固定時要切開。

2 切片、烤片及脫蠟

經過固定之后，標本要進行切片。切片時需做到切片輕薄且完整，非淋巴組織切片厚度一般為3到4微米，淋巴組織切片為2微米。因為在對切片若出現褶皺將很難清洗潔凈，會影響到染色效果，所以要保證切片平整。在進行切片清洗時，容器要潔凈以免產生意外污染，對閱片造成影響。進行烤片時，溫度要保持在70℃左右，時間為一到兩小時?？酒瑫r溫度以及時間太長過高會使標本抗原失去，時間過短則容易出現脫片現象?？酒筮M行脫蠟，脫臘工作不徹底會導致抗體與抗原之間結合受到阻擋。進行脫蠟時一般采用松節油，分為三級進行，每一級時間保證在15分鐘左右。松節油的使用為200片切片進行一次更換，這樣能夠保證脫蠟效果良好[1,3]。

3 降低非特異性染色

采用辣根過氧化物酶作為檢測系統，需在進行一抗滴加工作之前，將3%濃度過氧化氫滴加到切片上，保持15分鐘左右進行反應，將切片組織物中的內源性過氧化物酶進行消除，以免對檢測工作造成干擾。

4 設立對照組

進行免疫組化染色工作時，需要設立對照組。對照組的設立是非常重要的一項工作，設立對照組為陽性。因為闌尾組織中的組織成分較多，包括間質、神經組織以及淋巴組織和上皮組織等，所以通常會將闌尾選擇為陽性對照組[2]。

5 恢復抗原

進行抗原修復時，有多種方法，包括微波及高壓鍋修復等方法，在本文中選用高壓鍋修復法。具體的修復流程是：首先在高壓鍋內放入兩千毫升0.01摩爾每升，ph值為6.0的檸檬酸鹽緩沖液，然后將高壓鍋放到電磁爐上進行加熱，直至沸騰。其次，將電磁爐功率換成中檔，然后將切片放到高壓鍋內，然后將高壓鍋蓋蓋住，加減壓閥并再次進行加熱，當高壓鍋開始冒氣再維持兩分鐘，然后再熄火并進行冷卻。采用高壓鍋法進行抗原修復，擁有受熱及壓力穩定和切片背景著色淡的好處。除此之外，進行核染色陽性抗原修復時，最好的方法是采用ph值為9.0的EDTA修復液，胞質及胞膜染色陽性抗原修復也采用上述修復液，但ph值為8.0。

6 顯色

若已經完成配置的DAB顯色液底部有棕色沉淀物，那么此顯色液可能已經沒有效果，最好的辦法就是重新進行顯色液配制。在進行顯色時，顯色效果快速的位置是大范圍陽性分布或者是胞質組織有陽性定位的部位。相反的部位，在進行顯色時觀察效果不明顯，所以需要依靠顯微鏡。進行顯色觀察時，時間要掌握好不能過長，否則很容易使背景染色，對顯色效果造成影響。

7 復染

為了能夠使切片的陽性染色顯色效果達到最優，需要進行復染操作。因為進行切片的復染操作主要是為了使顯色達到更好效果，所以蘇木精的顏色應盡量保持清淡。而且在進行復染操作時，還須要用到吸附玻片，所以要對蘇木精進行及時的過濾，避免因為人為因素而造成背景被染色，對免疫組化染色顯色觀察效果造成嚴重影響[4]。

8 染色細節

在進行免疫組化染色操作時，需要注意以下幾個方面。首先，因為標本切片一旦干燥，就會使切片內部的抗原因失去水分而流失，這種情況會對后續的染色以及顯色工作造成嚴重影響，因此在整個染色過程中要確保切片能夠保持濕潤，以此保證免疫組化染色質量。其次，則是在進行一抗的滴加時，切片上的多余水分會使抗體被稀釋，所以要將切片上的水分進行清除。而且在進行抗體滴加時，要保證滴加的范圍能夠將所有組織都囊括進去，避免出現邊緣部位沒有覆蓋到抗體，出現邊緣效應現象。此外，在進行一抗滴加時要保證孵育盒的放置角度水平，以免在進行抗體的滴加時抗體從組織切片的一端流向另一端，避免后續的染色顯色結果出現假陰性亦或是部分弱陽性，降低染色工作效果，增加工作時間[5]。

9 結束語

結合上述論述內容，我們可以發現想要使免疫組化染色質量控制工作效果達到最優，需要將各項控制措施在實驗檢測之前進行實施，例如對標本及切片的處理工作。在免疫組化染色操作流程中，各項工作之間都會產生影響，而且這種影響是非常嚴重的。所以對于各項操作流程要嚴格按照順序進行，并對每一個步驟內的操作進行嚴格監督與控制，只有這樣才能使切片以及標本質量達到最優，為后續的染色及顯色工作奠定良好基礎。在進行操作時，工作人員需具有高度責任感，并且擁有嫻熟的操作技術，嚴格按照要求進行實驗操作。

(作者單位：河北省眼科醫院病理科)

[1]劉彤華.免疫組織化學規范化的問題[J].中華病理學雜志 ,2009,(10)：29.

[2]戴光強,龔西.診斷病理學分冊[M].合肥：安徽科學技術出版社 ,2003,(06)：55-57.

[3]斯向東,李慶.細胞塊切片及免疫組化在惡性漿膜腔積液診斷中的應用體會[J].中國現代醫生,2012,48(27)：115-116.

[4]張志剛,梁希軍,崔東輝,等.間皮細胞、癌胚抗原、角蛋白、波型蛋白在胸腔積液臨床診斷中的作用[J].中國全科醫學 ,2008,11(23)：2081-2082.

[5]張雯雯,孔慶暖,韓增磊,等.小細胞肺癌組織CD56、Syn及TTF1表達及聯合診斷意義[J].齊魯醫學雜志,2014,27(3)：108-110.

[6]趙海濱,楊樹東,周志華,等.腎原發性神經內分泌癌臨床病理觀察[J].診斷病理學雜志,2010,19(3)：120-122.