四川省九龍縣牦牛無形體病的調查

肖啟程，何勤欣，石 蘭，葉兵兵，涂 蕊

（1.四川民族學院 農學院，四川 康定 626000；2.四川省丹巴縣格宗鄉政府，四川 丹巴 626300）

牛無形體病是一種由蜱蟲叮咬宿主皮膚較薄處并吸食血液引起的寄生蟲疾病，急性發病時可導致動物死亡，流行比較廣泛，全國各地均有發生。該病易在牛、羊等哺乳動物體內傳播，也可感染人，尤其易感染放牧畜群，是一種人畜共患的自然疫源性疾病[1]。主要臨床癥狀表現為發熱、消瘦、食欲缺乏、體重減輕及內臟器官功能受損等[2]。牦牛極易成為該病易感動物。

九龍縣位于四川省西部、甘孜藏族自治州東南部，地處攀西高原和青藏高原交界處，平均海拔3 000～4 000 m，植被豐富，日照充足，動物種類眾多，其中最出名的經濟動物為九龍牦牛，是甘孜州農業發展的特色動物，兼具使用價值和經濟價值。九龍牦牛在當地以散養、放牧為主，由于牧民驅蟲意識淡薄，寄生蟲病時有發生。據報道，我國中南部、西南部、東北，臺灣及四川松潘縣、石渠縣等地均已發現牛無形體病[2-6]。為研究九龍牦牛是否感染該病，本研究采用PCR法對29份牦牛血液樣本進行檢測，以期為當地牛無形體病的控制和預防提供流行病學依據。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

2021年7月從甘孜藏族自治州九龍縣湯古鎮（15頭）和呷爾鎮（14頭）使用一次性無菌靜脈采血針和無菌EDTA抗凝管采集29頭牦牛頸靜脈血液保存于EDTA抗凝管中，并分別編號置于4℃采樣箱運回實驗室低溫保存待檢。

1.2 試劑與設備

血液基因組DNA提取試劑盒、2*Taq PCR Master Mix聚合酶、DL2000 DNA Marker，均購買于天根生化科技（北京）有限公司。紫外凝膠成像儀（Syngene 1467），PCR擴增儀（伯樂S1000），水平電泳槽（JY-SPFT型）。

1.3 引物合成

牛無形體和中央無形體16S rRNA特異性引物，及嗜吞噬細胞無形體引物均來源于文獻[7]，見表1。提交引物序列至成都擎科梓熙生物技術有限公司合成PCR特異性擴增引物。

表1 3種無形體特異性引物序列

1.4 血樣DNA提取

根據產品說明書按步驟采用血液基因組DNA提取試劑盒抽提29份牦牛全血基因組DNA，于-20 ℃保存備用。

1.5 PCR檢測

采用巢式PCR法分別對3種牛無形體進行擴增，所有引物擴增均采用25 μl體系，即模板2 μl，2×Taq PCR Mastermix 12.5 μl，上下游引物各1 μl，ddH2O 8.5μl。其中中央無形體上游引物為AC1F，下游引物為AC1R，牛無形體上游引物為AB1F，下游引物為AB2R，擴增條件均為變性95 ℃ 1 min，退火58 ℃ 1 min，72 ℃延伸1 min，40個循環。嗜吞噬細胞無形體第一輪上游引物為Eh-out1，下游引物為Eh-out2，第二輪上游引物為HGA1，下游引物為HGA2，擴增條件為變性95 ℃ 1 min，退火55 ℃ 1 min，72 ℃延伸1 min，40個循環。PCR擴增產物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，并經紫外凝膠成像儀分析擴增結果，雙向測通后，在NCBI中經Blast比對，并統計牦牛無形體病的感染率。

2 結果

本試驗共采集九龍縣29份牦牛血液樣本，提取DNA后通過巢式PCR法分別擴增3種無形體目的基因，牛無形體擴增結果見圖1，中央無形體擴增結果見圖2，嗜吞噬細胞無形體擴增結果見圖3。共檢出陽性樣品20份，總陽性率為68.97%（20/29），牛無形體、中央無形體和嗜吞噬細胞無形體的感染率分別為48.28%（14/29）、20.69%（6/29）、20.69%（6/29），見表2。29份樣本中僅存在一種無形體的感染率為51.72%（15/29），兩種無形體交叉感染率為13.79%（4/29），三種無形體同時存在的感染率為3.45%（1/29）。由此可見，該地牦牛無形體病的感染存在交叉類型，應引起高度重視。

圖1 牦牛血DNA樣本牛無形體擴增結果電泳圖

圖2 牦牛血DNA樣本中央無形體擴增結果電泳圖

圖3 牦牛血DNA樣本嗜吞噬細胞無形體擴增結果電泳圖

表2 3種無形體感染情況表

3 討論

據了解，全國牛無形體病的感染報道較多，沈雪鷹等[5]通過PCR方法檢測云南省騰沖市331份牛血液樣本，陽性率為42.6%；姚明國等[8]檢測云南西北部555份牛血液樣本，陽性率為41.08%；孫明等[9]通過相關試驗發現甘肅省河西走廊牦牛血液樣本無形體感染率僅為4.6%，這些結果均低于本試驗調查結果。九龍縣牦牛無形體病的高感染率，一方面，與當地對無形體病的認識和了解不足，養殖方式不科學及預防控制意識淡薄有密切聯系，且當地養殖以散養為主，若不及時進行驅蟲，極易通過蜱蟲叮咬傳播，引起牦牛無形體病的高感染情況；另一方面，可能由于血液樣本數量較少，取樣代表性不足，對結果造成影響，建議在以后的科學研究中做出合理安排，增加采樣量及樣本采集的科學性，盡可能地減少試驗的系統誤差。

此外，牦牛不僅能感染牛無形體、嗜吞噬細胞無形體和中央無形體，還可感染羊無形體。目前已證實嗜吞噬細胞無形體和羊無形體能感染人，引起與動物無形體病類似的癥狀[8]。本研究發現四川省甘孜藏族自治州九龍縣牦牛存在牛無形體病的感染，且存在交叉感染的情況，嗜吞噬細胞無形體感染率達20.69%，表明當地可能存在人感染無形體病的情況，應引起足夠重視。牦牛無形體病除了對牦牛養殖業造成直接經濟損失，也會降低肉類品質和奶產量，影響其經濟價值，甚至會危及人類及其他動物的健康。因此，應廣泛宣傳，提高個人的認知與防護意識，及時接種免疫，增強易感動物機體免疫力。同時，切斷傳播途徑，在推進養殖業發展的同時保障人類健康。

4 結論

本研究通過巢式PCR法調查四川省甘孜藏族自治州九龍縣牦牛29份血液樣本牛無形體病流行情況，結果表明該地牦牛無形體病感染率為68.97%，且存在人類易感的嗜吞噬細胞無形體，應加強對該病的預防、控制和宣傳，從而保障人和動物的健康。