安可膠對BALB/c小鼠的免疫原性影響

司 瑋許辭中劉 晶

1南京市食品藥品監(jiān)督檢驗院 江蘇省南京市 210000 2南京市餐飲服務(wù)食品安全監(jiān)督所 江蘇省南京市 210000 3江蘇省藥物研究所 江蘇省南京市 210000

安可膠對BALB/c小鼠的免疫原性影響

司 瑋1許辭中2劉 晶3

1南京市食品藥品監(jiān)督檢驗院 江蘇省南京市 210000 2南京市餐飲服務(wù)食品安全監(jiān)督所 江蘇省南京市 210000 3江蘇省藥物研究所 江蘇省南京市 210000

目的：研究安可膠的免疫原性和免疫效果，為該藥物安全評價和進一步優(yōu)化提供實驗依據(jù)。方法：安可膠是模仿凝血機制的最后共同通路設(shè)計成的止血制劑，自2015年2月至2015年8月，本研究在江蘇省藥物安評中心進行，按臨床等效劑量設(shè)高中低劑量組及空白對照，通過對32例BALB/c小鼠免疫器官質(zhì)量及臟器指數(shù)分析、噻唑藍(MTT)比色法檢測脾淋巴細胞增殖、氯化硝基四氮唑藍(NTB)還原法檢測中性粒細胞吞噬能力，揭示安可膠對小鼠免疫系統(tǒng)的影響。結(jié)果：小鼠免疫器官質(zhì)量及臟器指數(shù)均未發(fā)生明顯改變；與對照組相比，各組小鼠淋巴細胞增殖指數(shù)無明顯差異，試驗組中性粒細胞吞噬功能顯著性增強，粒細胞吞噬百分率升高，與陰性組相比，有極顯著統(tǒng)計學差異。結(jié)論：安可膠可增加脾細胞的轉(zhuǎn)化能力，并對小鼠免疫器官重量有影響，但在小鼠體內(nèi)未表現(xiàn)出特異性免疫反應(yīng)。

安可膠；免疫原性抗體；抗凝

安可膠是模仿凝血機制的最后共同通路設(shè)計成的止血制劑，由兩種成分組成，A液含較高濃度的纖維蛋白原和XIII因子，B液含鈣離子和凝血酶，兩液混合后纖維蛋白原和凝血酶接觸，形成類似外凝血過程的最后階段，產(chǎn)生可溶性多聚體纖維蛋白網(wǎng)，發(fā)揮止血封閉作用，并能有效促進創(chuàng)面愈合[1、2]。但由于本品來源于哺乳動物的血清，因此其免疫原性研究對該品種在臨床上的安全應(yīng)用及推廣顯得尤為重要。自2015年2月起，至2015年8月，本研究對安可膠進行免疫原性試驗，觀察其對32例BALB/c小鼠免疫系統(tǒng)的影響，為臨床用藥安全提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物

BALB/c小鼠：SPF級32只18-21g，隨機分成4組，每組8只，雌雄各半。

1.2 主要試劑

刀豆蛋白A（ConA）：SIGMA公司提供；脂多糖（LPS）：SIGMA公司提供；四甲基偶氮唑蘭（MTT）：Amresco公司提供；氯化硝基四氮唑藍（NBT）：上海靈錦精細化工有限公司提供；十二烷基磺酸鈉（SDS）：Amresco公司提供；番紅花紅T：上海靈錦精細化工有限公司提供。

2 試驗方法

2.1 給藥方法及檢測

采用安可膠100 mg/kg、 50 mg/kg、25 mg/kg、陰性對照4組，注射給藥后第7天，采抗凝血0.5 ml，加入等量的NBT溶液。番紅花紅T染色，洗滌，干燥，油鏡檢測。血涂片中嗜中性粒細胞能還原NBT10%以下，為NBT試驗陰性，10%以上則為陽性。

2.2 免疫器官重量

給藥第7天稱體重，取胸腺、脾臟稱重，計算免疫器官指數(shù)[3]。

胸腺或脾臟指數(shù) =

2.3 小鼠T、B淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗

給藥第7天，脾臟剪碎后過200目不銹鋼篩網(wǎng)，用PBS預冷沖洗后收集細胞懸液，以1000 rpm離心5min，棄上清液，用 NH4Cl 裂解紅細胞，重復離心棄上清后，用完全培養(yǎng)基調(diào)細胞濃度至1.0×106/ ml， 96孔板內(nèi)每孔加入180ul。每只動物設(shè)PBS 對照孔、ConA刺激孔(ConA終濃度10ug/ml)、LPS刺激孔(LPS終濃度10ug/ml)。在37℃下孵育48 h，棄上清100ul，加入10ul MTT工作液，加入100ul 10% SDS裂解結(jié)晶紫顆粒，于570 nm波長紫外測A570值，并計算細胞增殖指數(shù)（Proliferation index，Prol.）[3、4]。

2.4 統(tǒng)計方法

采用SPSS12.0軟件中one-way ANOVA進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果P<0.05 表示有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 安可膠對免疫器官指數(shù)的影響

由表1可以看出，給于安可膠后，小鼠的胸腺和脾臟重量有一定程度的增加，但與陰性對照組相比，差異不很明顯。

3.2 安可膠對脾細胞轉(zhuǎn)化的影響

細胞增殖實驗表明，給于安可膠后，脾細胞在ConA誘導下，增殖能力增強，增殖指數(shù)有一定程度的增加，但與陰性對照組相比，無統(tǒng)計學差異（見表2）。

3.3 安可膠對嗜中性粒細胞功能的影響

嗜中性粒細胞還原NBT試驗結(jié)果表明，安可膠能明顯增強嗜中性粒細胞的吞噬功能，與空白組相比，差異極顯著（見表3）。

4 結(jié)論

在臨床上安可膠可與凝血酶混合使用形成纖維蛋白，在臨床外科止血、組織創(chuàng)傷修復等都有非常好的作用。因有生物相容性好，緩釋作用強和無毒性等優(yōu)點已被廣泛應(yīng)用[5]。安可膠作為類似生物制品發(fā)展前景樂觀，但尚有許多問題待解決：其中最重要是對其有效性和安全性的研究。本試驗采用了BALB/C小鼠動物模型來評價其對免疫原性和免疫系統(tǒng)的刺激情況。

雷靜等研究表明，小鼠體內(nèi)的纖維蛋白膠主要影響凝血系統(tǒng)，對免疫系統(tǒng)的脾臟也有影響，可能存在潛在的免疫毒性[6]。本研究為了有效的考量安可膠的安全性，設(shè)計通過小鼠腹腔局部注射安可膠并測定免疫后動物臟器指數(shù)，以了解相應(yīng)免疫原性及免疫毒性強弱。給藥后小鼠主要免疫器官臟器增重及指數(shù)與陰性對照組相比變化不明顯，均無統(tǒng)計學差異。表明在小鼠體內(nèi)該制劑對其免疫器官的影響程度不髙，且與劑量無關(guān)。

在前期的研究中有結(jié)果提示，纖維蛋白可主要通過淋巴細胞介導特異性免疫反應(yīng)[7]，纖維蛋白原對小鼠成纖維細胞以及兔皮膚可能有一定的毒性作用[8]。但在本研究中，ConA作為一種有絲分裂原，可誘導淋巴細胞產(chǎn)生細胞毒性作用。再通過MTT試驗進行檢測其增殖轉(zhuǎn)化程度，用酶標儀測定ConA和LPS等指標，其光吸收值即可間接反映活細胞數(shù)量。MTT結(jié)晶形成的量與細胞數(shù)在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，也可以反應(yīng)與該細胞的增殖程度成正比。在本實驗最終結(jié)果中，各組小鼠脾臟淋巴細胞增殖能力和陰性對照組小鼠脾臟淋巴細胞增值能力基本相當。與陰性對照組相比，對脾臟器官重量及脾細胞轉(zhuǎn)化均稍有升高，但無統(tǒng)計學差異。說明安可膠刺激小鼠免疫應(yīng)答不明顯，對其特異性免疫影響很小，且與用藥具體劑量無關(guān)性，從而也說明了其具有一定的安全性。

表1：安可膠對小鼠免疫器官的影響(n=8,)

表1：安可膠對小鼠免疫器官的影響(n=8,)

組 別劑 量(mg/kg)胸腺重(mg)脾臟重（mg）胸 腺 指 數(shù)(mg/g)脾臟指數(shù) (mg/g)陰性對照組-37.625±9.96789.875±10.1481.737±0.5024.155±0.770低劑量組25.042.563±13.58991.250±10.9641.970±0.6744.193±0.456中劑量組50.039.063±8.65797.875±15.0941.753±0.4194.400±0.826高劑量組100.045.000±9.815101.500±13.8872.060±0.5054.643±0.768

表2：安可膠對脾細胞轉(zhuǎn)化的影響(n=8,)

表2：安可膠對脾細胞轉(zhuǎn)化的影響(n=8,)

組 別劑 量(mg/kg)A570(ConA)A570(LPS)增殖指數(shù)(ConA)增殖指數(shù)(LPS)陰性對照組-0.415±0.1510.308±0.058169.6±88.0100.3±27.3低劑量組25.00.478±0.1270.305±0.096230.9±82.1111.6±69.8中劑量組50.00.576±0.2330.360±0.063254.3±88.2130.1±38.2高劑量組100.00.601±0.4410.342±0.163246.9±171.0109.4±65.6

表3：安可膠對嗜中性粒細胞功能的影響(n=8,)

表3：安可膠對嗜中性粒細胞功能的影響(n=8,)

與陰性對照組比：*** p<0.001

組 別劑 量(mg/kg) 吞噬百分率（%）陰性對照組-8.33±4.69低劑量組25.032.50±12.56***中劑量組50.035.82±6.11***高劑量組100.037.50±17.44***

中性粒細胞在體內(nèi)發(fā)揮吞噬病菌的功能，小鼠體內(nèi)的中性粒細胞吞噬功能增強，在本研究的結(jié)果中，安可膠對可使嗜中性粒細胞功能明顯增強，各給藥組粒細胞吞噬百分率與陰性對照組相比顯著增加，統(tǒng)計結(jié)果有極顯著差異。這也提示安可膠是異源蛋白，在小鼠體內(nèi)可引起非特異性免疫作用。小鼠試驗安可膠在體內(nèi)所表現(xiàn)的特異性免疫反應(yīng)不明顯。

綜上所述，本研究在小鼠體內(nèi)未表現(xiàn)出特異性免疫反應(yīng)，但可部分預測安可膠對人的免疫原性反應(yīng)，對于臨床應(yīng)用亦可作為參考和提示。

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司瑋（1981-），女，江蘇省南京市人。碩士學位。現(xiàn)為南京市食品藥品監(jiān)督檢驗院工程師，主要從事食品藥品安全研究工作。

劉晶（1973-），男，江蘇省鹽城市人。碩士學位?，F(xiàn)為南京市餐飲服務(wù)食品安全監(jiān)督所研究員，主要從事食品藥品安全研究工作。