番茄花粉發(fā)育時期與花蕾大小關(guān)系的研究

高 慧， 李 昂， 陳雙越， 齊海軍， 楊 陽， 金東淳*

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002;2.吉林省中玉農(nóng)業(yè)有限公司，吉林 長春 130000)

番茄花粉發(fā)育時期與花蕾大小關(guān)系的研究

高 慧1， 李 昂1， 陳雙越1， 齊海軍1， 楊 陽2， 金東淳1*

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002;2.吉林省中玉農(nóng)業(yè)有限公司，吉林 長春 130000)

以“賊不偷”番茄品種為材料，采用DAPI染色方法研究了番茄花粉發(fā)育時期與花蕾長度的關(guān)系。結(jié)果表明：同一朵花的不同花藥中花粉粒的發(fā)育時期基本一致,并且番茄花的長度與花粉粒的發(fā)育時期也有著較嚴格的對應(yīng)關(guān)系。當花蕾長度小于0.4 cm時，花粉基本處于小孢子母細胞時期；長度為0.4～0.6 cm時，為花粉發(fā)育的二分體時期；長度為0.6～0.7 cm時,為四分體時期；長度為0.7～0.8 cm時，為單核居中期；長度為0.8～0.9 cm時，為單核靠邊期；長度為0.9～1.1 cm時，為二核花粉期；長度大于1.1 cm時，基本為成熟的小孢子。

番茄；花蕾長度；花粉粒；發(fā)育時期

植物花藥培養(yǎng)中，花粉的發(fā)育時期是影響花藥(花粉)培養(yǎng)效果的重要因子之一[1-11]。很多花藥培養(yǎng)研究結(jié)果表明，不同發(fā)育時期的花粉粒對花粉培養(yǎng)的效果有很大差異，選擇適宜發(fā)育時期的花粉粒是決定花粉培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵，一般認為單核中期或單核靠邊期是花粉培養(yǎng)的最佳時期。而花粉培養(yǎng)需從許多花或花藥當中取花粉粒，對每一朵花或花藥進行鏡檢并確定其花粉發(fā)育時期既費時費力，又會對小孢子活力造成一定的損傷。所以針對某一植物進行花粉培養(yǎng)時接到一些能夠準確判斷其花粉發(fā)育時期形態(tài)等標記是非常有必要的。植物中有許多關(guān)于花(或花蕾)長度與花粉發(fā)育時期關(guān)系的相關(guān)研究，表明花(或花蕾)的長度與花粉發(fā)育階段存在密切關(guān)系[12-13]。關(guān)于番茄曾有過花粉發(fā)育時期與花藥培養(yǎng)效應(yīng)的研究[14]，但尚無花粉發(fā)育時期與花粉培養(yǎng)的相關(guān)研究。本試驗篩選出對花粉培養(yǎng)響應(yīng)較好的、適合番茄花粉培養(yǎng)的“賊不偷”番茄品種為試驗材料，著重研究小孢子各發(fā)育時期的細胞學(xué)特征以及不同發(fā)育時期與花蕾大小的相關(guān)性，以便直接從花(或花蕾)的長度來推斷小孢子的發(fā)育時期，為番茄花藥或小孢子培養(yǎng)提供簡單易行的小孢子發(fā)育時期鑒定方法。對進一步優(yōu)化花粉培養(yǎng)條件及提高胚狀體的誘導(dǎo)效率、以及建立番茄花粉培養(yǎng)體系等諸方面也具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

從市場購買“賊不偷”番茄品種的種子，育苗后移栽至溫室大棚栽培，在盛花期采集新鮮的、不同長度的花蕾為材料。

1.2 方法

采摘生長健壯的第1花序中的花,從花蕾基部到頂部測量長度,并根據(jù)花的大小分為7種不同長度:A(0～4 mm)，B(4～6 mm),C(6～7 mm),D(7～8 mm),E(8～9 mm),F(9～11 mm ),G(11 mm以上)(圖1)。取不同長度的花蕾(各5個)，分離花藥(一朵花蕾中通常有5～6個花藥)，于卡諾固定液(乙醇∶冰乙酸=3∶1)中固定24 h。取出后,用檸檬酸/磷酸緩沖液(pH值為4)中和固定2 h。用鑷子取出花藥并用解剖刀切開,輕輕壓片。先在載玻片上滴1滴2 mg/L(2 mgDAPI溶于1 L蒸餾水)的DAPI染色液,置花藥于此液體中進行簡易壓片,置于黑暗中10 min。用Olympus落射式熒光顯微鏡，分別在10×10、10×20、10×40(目鏡×物鏡)倍鏡下，每片觀察3個視野確定花藥小孢子的發(fā)育時期并照相。其中，熒光激發(fā)光λ=358 nm[15]。

注：A(0～4 mm)、B(4～6 mm)、C(6～7 mm)、D(7～8 mm)、E(8～9 mm)、F(9～11 mm)、G(11 mm 以上)

圖1 “賊不偷”番茄品種不同發(fā)育時期花蕾的外觀形態(tài)

Fig.1 The exterior forms in different development periods of buds in “zeibutou” tomato

2 結(jié)果與分析

通過對不同大小番茄花蕾花粉發(fā)育的顯微觀察，發(fā)現(xiàn)番茄花蕾的大小與小孢子發(fā)育時期有一定的關(guān)系。根據(jù)不同時期花粉的形態(tài)特征，番茄花粉粒的發(fā)育可分為小孢子母細胞時期、二分體時期、四分體時期、單核居中期和單核靠邊期、二核花粉期、成熟小孢子等7個階段。

該試驗主要采用DAPI熒光染色劑對番茄不同發(fā)育時期的細胞進行觀察，而沒有選用植物花粉研究中最常用的醋酸洋紅染色劑，主要是因其特異性差，在清晰觀察花粉細胞核的動態(tài)變化中存在局限性。DAPI是能夠與核物質(zhì)(DNA)特異性結(jié)合的熒光染料，是觀察、研究細胞核動態(tài)變化的理想染色劑，已廣泛地應(yīng)用于細胞分子生物學(xué)等各個領(lǐng)域, 其中較多地應(yīng)用于動物癌細胞、胚胎細胞以及植物染色體帶型、異染色質(zhì)等研究[16-17]。但它在檢測花粉粒發(fā)育時期的應(yīng)用報道較少, 有關(guān)檢測番茄花粉粒發(fā)育的文獻就更少，這主要是由于厚而堅硬的花粉壁阻礙染色劑的滲透。該試驗通過有效的固定以及中和固定等前處理, 在保證維持花粉粒正常形態(tài)的同時,有效地軟化花粉壁,使 DAPI 能夠滲透進入到花粉粒中, 并準確、清晰地觀察到了花粉母細胞、四分體、單核花粉粒和二核花粉粒等不同發(fā)育時期細胞核的動態(tài)變化。這一染色方法也為番茄游離小孢子培養(yǎng)以及胚狀體發(fā)育過程的動態(tài)變化研究奠定了堅實的基礎(chǔ)。

2.1 番茄花粉發(fā)育特性

番茄小孢子的形成和花粉粒的發(fā)育與黃瓜[18]、辣椒[19]花粉粒的發(fā)育相似。在小孢子母細胞時期，細胞核大，無明顯的液泡，表現(xiàn)為細胞著色較深，在小孢子母細胞的四周沉積1層胼胝質(zhì)物質(zhì)。小孢子母細胞第1次減數(shù)分裂后產(chǎn)生分隔壁，將母細胞分為2個子細胞，即二分體，2個核同步進行第2次分裂，分裂后在4個核之間產(chǎn)生細胞壁形成四面體型的四分體和兩側(cè)對稱型四分體。制片觀察到四分體四周的胼胝質(zhì)壁并非完全規(guī)則地包裹著四分體。包裹在四分體四周的胼胝質(zhì)被分解后，小孢子從中游離出來彼此分開，小孢子釋放出來,此時在花粉壁上可觀察到3個呈凸透鏡形狀的萌發(fā)孔。剛游離出來的小孢子細胞質(zhì)濃厚，細胞核位居中央，此期為單核中期，細胞質(zhì)內(nèi)液泡不明顯，細胞壁呈收縮狀態(tài)為小孢子收縮期。隨著小孢子從四周汲取養(yǎng)料，細胞體積逐漸增大，液泡逐漸發(fā)育為大液泡，并將細胞核擠到邊上，此期為單核靠邊期。而后細胞質(zhì)逐漸充滿整個細胞，細胞核進行1次不均等有絲分裂，形成雙核，靠花粉壁的為生殖細胞，占據(jù)細胞中央的為營養(yǎng)細胞。番茄成熟的花粉粒為二細胞花粉粒，在花粉壁上可觀察到明顯的3個呈凹透鏡形狀的萌發(fā)孔,這與朱麗萍[20]的結(jié)果基本相似。

2.2 番茄花粉發(fā)育時期與花蕾大小的關(guān)系

按花蕾大小觀察每個等級番茄花蕾的花粉粒發(fā)育特性，結(jié)果表明：花蕾小于0.4 cm時，花粉粒處在花粉母細胞減數(shù)分裂期(圖2-A)，此期可觀察到番茄(2n=2x=24)有12對染色體(圖2-B)?；ɡ俅笮?.4～0.6 cm 時，花粉母細胞均等的分裂成2個子細胞，此期為花粉粒二分體時期(圖2-C,D)。花蕾大小為0.6～0.7 cm時，花粉粒處在四分體時期(圖2-E,F)。這一時期的花蕾中可以觀察到被胼胝質(zhì)包圍的單核的四分體?；ɡ俅笮?.7～0.9 cm時，花粉粒處在單核花粉期。熒光顯微鏡下可觀察到從四分體四周胼胝質(zhì)分解后游離出來的核位居中央的小孢子，此期為花粉粒單核居中期(圖2-G,H)。隨著花粉粒的不斷發(fā)育膨大，可觀察到小孢子中的大液泡把細胞核擠到一邊，此期為花粉粒單核靠邊期(圖2-I)?；ɡ俅笮?.9～1.1 cm時，熒光顯微鏡下可觀察到2個大小不一、亮度不同的細胞核。由于有絲不均等分裂，形成的細胞核一個大一個小。體積大的為營養(yǎng)細胞核(V)，核大，顏色較淺；體積小的為生殖細胞核(G)，核小，顏色較亮；此時期為花粉粒二核花粉期(圖2-J)?；ɡ俅笮?.1 cm以上時，番茄花粉粒趨于成熟，屬發(fā)育后期。此時期用油鏡(10×100)能明顯觀察到3個呈凹透鏡形狀的萌發(fā)孔(圖2-K,L)。

3 討論與結(jié)論

很多相關(guān)植物游離小孢子的研究結(jié)果一致認為，很多因素影響單倍體的誘導(dǎo)效果，如基因型、花粉發(fā)育時期、脅迫處理、激素、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件等。其中，選擇適當?shù)幕ǚ郯l(fā)育時期是能否成功誘導(dǎo)單倍體的前提與關(guān)鍵，普遍認為單核靠邊期是花粉培養(yǎng)的最佳時期。而對每一朵花粉粒都鑒定其發(fā)育時期，不僅耗時耗力，又損傷花粉粒。為此本文探討了“賊不偷”番茄品種花蕾大小與花粉發(fā)育時期間的關(guān)系。以期能夠直接從花(或花蕾)的長度來推斷小孢子的發(fā)育時期，為番茄花藥或小孢子培養(yǎng)提供簡單易行的小孢子發(fā)育時期鑒定方法，從而提高花粉或花藥培養(yǎng)的誘導(dǎo)率。

“賊不偷”番茄品種是我實驗室篩選出的、對花粉培養(yǎng)響應(yīng)較好的、適合番茄花粉培養(yǎng)相關(guān)研究的好材料，在預(yù)備試驗中曾誘導(dǎo)出較高頻率的胚狀體(相關(guān)結(jié)果將在后續(xù)論文中發(fā)表)。結(jié)果表明，“賊不偷”番茄品種的花蕾長度小于0.4 cm時，花粉基本處于小孢子母細胞時期；長度為0.4～0.6 cm時，為二分體時期；長度為0.6～0.7 cm時,為四分體時期；長度為0.7～0.8 cm時，為單核居中期；長度為0.8～0.9 cm時，為單核靠邊期；長度為0.9～1.1 cm時，為二核花粉期；當長度大于1.1 cm時，基本為成熟的小孢子?；ɡ俅笮∨c花粉發(fā)育時期間存在高度相關(guān)性。這一結(jié)果為本實驗室正在進行的番茄花粉離體培養(yǎng)研究提供了重要的參考。

目前，在擬南芥、水稻、油菜等模式植物中已建立了成熟的花粉培養(yǎng)體系。而番茄的單倍體誘導(dǎo)研究多集中在花藥培養(yǎng)，吳志蘋[21]曾通過番茄小孢子離體培養(yǎng)獲得胚狀體，但至今尚無相關(guān)通過游離小孢子培養(yǎng)獲得番茄單倍體植株的報道，這有待我們進一步的研究。植物單倍體的誘導(dǎo)主要采用花藥和花粉培養(yǎng)方法，而通過游離小孢子培養(yǎng)誘導(dǎo)單倍體的方法有著可排除單倍體誘導(dǎo)過程中其他體細胞的干擾、可獲得大量的單倍體等很多優(yōu)勢。通過植物花粉培養(yǎng)可在短時間內(nèi)獲得大量的純合的雙單倍體(HD)來加快育種進程，同時也在構(gòu)建遺傳圖譜群體以及植物細胞全能性研究等很多理論性研究中有著廣泛的應(yīng)用前景。

A,B為小孢子母細胞時期；C,D為花粉粒二分體時期；E,F為花粉粒四分體時期；G,H為花粉粒單核居中期；I為花粉粒單核靠邊期；J為花粉粒二核期；K,L為成熟的小孢子。A～J倍率為10×40(Bar=15 μm);K,L倍率為10×100(Bar=18 μm)。

圖2 番茄“賊不偷”不同發(fā)育時期細胞學(xué)觀察結(jié)果

Fig.2 The results of cytology observation in different development periods of “zeibutou” of tomato

[1] 武劍,龔義勤,柳李吒,等.十字花科蔬菜花粉植株誘導(dǎo)技術(shù)研究展望[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2000,28(06):747-749.

[2] 李靖,李煥秀,李敏,等.蔬菜花藥培養(yǎng)研究進展[J].中國蔬菜,2005(06):36-39.

[3] 王小霞,樊新民,崔輝梅.蕓薹屬蔬菜花藥培養(yǎng)研究進展[J].北方園藝,2007(01):35-37.

[4] 周林,韓金星,黃金艷,等.葫蘆科蔬菜花藥培養(yǎng)研究進展[J].中國瓜菜,2009(01):32-35.

[5] 司軍,李成瓊.番茄花藥培養(yǎng)研究進展及展望[J].生物學(xué)雜志,2002,18(01):4-6.

[6] 周林,曾國平.番茄花藥培養(yǎng)研究進展[J].北方園藝,2007(11):85-87.

[7] 劉曉榮,陶承光,呂書文,等.番茄花藥培養(yǎng)研究進展[J].華北農(nóng)學(xué)報,2008,23(S1):31-33.

[8] 龍洪進.國內(nèi)外辣椒(C.auunnm)單倍體育種技術(shù)研究進展[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報,2004,17(S1):439-443.

[9] 張馨宇,王永成,劉愛群,等.辣椒花藥培養(yǎng)研究新進展[J].中國農(nóng)學(xué)通報,2007,23(08):331-334.

[10] 陳斌,耿三省,張曉芬,等.辣椒單倍體培養(yǎng)研究進展[J].長江蔬菜,2007(12):36-41.

[11] 齊衛(wèi)強,郭玲娟,孫治強.茄子花藥和花粉培養(yǎng)技術(shù)研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(12):4929-4931.

[12] 張菊平.辣椒花藥小孢子培養(yǎng)及其胚狀體發(fā)生機理研究[D].咸陽：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2007.

[13] 王薇薇.甜瓜小孢子發(fā)育時期與花器形態(tài)的關(guān)系[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)2015,43(04):108-112.

[14] 韋鵬霄,鄧發(fā)啟,岑秀芬,等.番茄溫敏核不育系花粉發(fā)育及其對愈傷組織誘導(dǎo)的效應(yīng)[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(17):8926-8929.

[15] 王洪燕.利用DNA熒光探針DAPI檢測番茄花粉粒的發(fā)育時期[J].棗莊學(xué)院學(xué)報,2006,23(02):93-94.

[16] Kapuscinski J.DAPI:A DNA-specific fluorescent probe[J].Biotechnic and Histochemistry,1995,70:220-233.

[17] Vergen J,Delvallee I,Dumas C.Rapid assessment of microspore and pollen development stage in Wheat and Maize using DAPI and membrane permeabilization[J].Stain Technology,1987,62:299-304.

[18] 陳芬芬,高慧,金東淳,等.黃瓜花蕾大小與花粉發(fā)育時期相關(guān)性研究[J].延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報,2016,38(02):134-138.

[19] 石太淵,印東生,胡迎雪,等.辣椒雄性不育系小孢子發(fā)生的細胞形態(tài)學(xué)及減數(shù)分裂觀察[J].遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué),1999(06):7-10.

[20] 朱麗萍,陳火英,莊天明,等.番茄不同花藥長短及花粉發(fā)育時期其愈傷組織誘導(dǎo)率的相關(guān)性[J].上海交通大學(xué)學(xué)報,2005,23(03):239-243.

[21] 吳志蘋,番茄花藥和小孢子離體培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化雄性不育基因Barnase的研究[D].石河子:石河子大學(xué),2010.

Studies on the relationship between bud size and pollen development stage in tomato

GAO Hui1, LI Ang1, CHEN Shuangyue1, QI Haijun1, YANG Yang2, JIN Dongchun1*

(1.AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,YanjiJilin133002,China;2.ZhongyuagricultureCo.,Ltd.ofJilin,ChangchunJilin130000,China)

In present study, the buds with different sizes of tomato variety of “zeibutou” as material, the relationship between bud length and pollen development stage were investigated using DAPI staining method. The results showed that the pollens in different anthers of the same flower were at the identical pollen development stage and, the bud length was strictly corresponding to the pollen development stage. When the bud was shorter than 0.4 cm, most of the pollens were at the microsporocyte stage; the buds were from 0.4 to 0.6 cm, the pollens were at the dispore stage; the buds were 0.6 to 0.7 cm, the pollens were at the trispore stage. When the buds were 0.7 to 0.8 cm, the pollens were at the early uninuclear stage; the buds were 0.8 to 0.9 cm, the pollens were at the late uninuclear stage; the buds were 0.9 to 1.1 cm, the pollens were at the binuclear stage. When the bud was greater than 1.1 cm, the pollens were at the mature microspore stage.

tomato; bud length; pollen; development stage

2016-10-21 基金項目：國際合作研究項目(延邊大學(xué)—韓國農(nóng)村振興廳國立園藝特作研究院)

高慧(1992—),女，山西大同人，在讀碩士，研究方向為植物花粉發(fā)育機理研究。金東淳為通信作者，

E-mail:jdc1200@ybu.edu.cn

1004-7999(2016)04-0346-05

10.13478/j.cnki.jasyu.2016.04.012

S641.2

A