幾種因素對白鶴芋組培苗增殖生長的影響

韓 璐， 修景潤， 代 月， 廉美蘭， 尹光浩， 金美玉*

(1.延邊大學農學院，吉林 延吉 133002；2.延邊朝鮮族自治州農業科學院，吉林 龍井 133400;3.延邊州農業技術推廣總站,吉林 延吉 133000)

幾種因素對白鶴芋組培苗增殖生長的影響

韓 璐1， 修景潤2， 代 月2， 廉美蘭1， 尹光浩3， 金美玉1*

(1.延邊大學農學院，吉林 延吉 133002；2.延邊朝鮮族自治州農業科學院，吉林 龍井 133400;3.延邊州農業技術推廣總站,吉林 延吉 133000)

為尋找一種簡單、低成本及可規模化生產模式，以白鶴芋組培苗單株(2 cm)為外植體，研究不同培養方法、接種量、通氣量和糖種類對白鶴芋組培苗生長的影響。結果表明：利用接觸式生物反應器培養，有利于白鶴芋叢生芽增殖，組培苗葉色濃綠，鮮重和干重高于其它處理。同時，在接種量60個單株、通氣量為0.3 vvm的處理中達到最佳效果。為大規模培養節約成本，糖種類選擇了白糖。

白鶴芋；組培苗；接種量；通氣量；生物反應器

白鶴芋(Spathiphyllumfloribundum)，又名白掌、包葉芋、一帆風順，屬天南星科(Araceae)、白鶴芋屬多年生草本植物，原產熱帶美洲，其中許多種或雜交種是重要熱帶花卉[1]。其葉片翠綠，花色潔白，非常清新優雅，可以過濾室內廢氣，是世界重要的觀賞花[2]。20世紀初應用于盆栽觀賞，到80年代歐洲已十分流行。白鶴芋組織培養研究始于20世紀70年代末[3-4]，主要利用芽的外植體獲得叢生芽，增殖后生根培養并獲得大量植株，其主要目的是滿足育種和生產上的需求。快速繁殖白鶴芋的有效途徑是進行組織培養，已有的報道中用白鶴芋的莖段，莖尖，葉片和頂芽為外植體都有成功的先例[5-7]。

白鶴芋屬植物因花粉退化，正常條件下不結籽，主要為無性繁殖，但繁殖系數低、速度慢，不能滿足市場需求。組織培養可以將繁殖系數提高幾十倍，加速良種繁育速度，目前，利用組織培養對白鶴芋進行快速繁殖的報道雖有一些，但其結果因其品種不同，仍然存在許多差異[8]。因此，本研究旨在建立一個全新的試驗體系，利用生物反應器進行液體培養，研究白鶴芋組培苗增殖的最佳條件，使白鶴芋組培苗的增殖系數更高，彌補固體培養操作繁瑣、成本高、周期長的問題，為今后運用生物反應器進行增殖培養和實現白鶴芋組培苗壯苗的大規模生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為白鶴芋組培苗，從韓國忠北大學引進，培養在 MS[9]固體培養基中，進行增殖培養。

生物反應器為本實驗室自行研制的氣球型氣升式生物反應器(3 L)，培養基為MS液體培養基。

1.2 方法

1.2.1 不同培養方法對白鶴芋生長的影響

利用3 L氣升式球形生物反應器分別進行接觸培養及間歇浸沒培養，以傳統組培的固體培養作為對照。

1) 生物反應器培養 在生物反應器離底部10 cm處架一支持網，使接種的每個外植體單株在支持網上生長。每個反應器均加入MS+BA 2.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+蔗糖30 g/L(pH值5.8)的培養基2.0 L，接入50個單株，培養基中通入0.20 vvm(air volume/culture volume/min)的氣體，每個處理接種3個反應器作為重復。

2) 間歇浸沒式培養 1 h供應1次培養基，每天供應12次。

3) 接觸式培養 為確保外植體在生物反應器的支持網上始終與培養基接觸，根據培養基消耗情況，定期補充培養基。

4) 固體培養 在200 mL的PC瓶中，加入25 mL培養基，培養基成分為MS+BA 2.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+瓊脂粉8.0 g/L(山東濟南普朗特生物科技有限公司)，pH值調節為5.8。每瓶接入2個單株，每組處理10瓶，3次重復。培養溫度(25±2) ℃，相對濕度70%，光照強度1 600 lx，每天光照16 h，40 d后調查株高、叢生芽數、鮮物重和干物重。

1.2.2 接種量對白鶴芋組培苗增殖生長的影響

在3 L氣升式氣球型生物反應器內進行接觸式培養。接種量設置為每個反應器接入40、50、60和70個單株，培養基通氣量調節為0.20 vvm，每個處理重復3次。培養條件及調查方法同1.2.1。

1.2.3 通氣量對白鶴芋組培苗增殖生長的影響

3 L反應器內(含2 L培養基)接入60個單株的白鶴芋組培苗(2 cm)進行接觸式培養，通氣量調節為0.1、0.2、0.3、0.4 vvm，培養基及培養方式同1.2.2，每個處理重復3次。培養條件及調查方法同上1.2.2。

1.2.4 碳源對白鶴芋組培苗增殖生長的影響

在含有2 L培養液的3 L反應器里，通入的空氣量調節為0.30 vvm，白鶴芋組培苗的接種量為60個植株，取30 g/L的白糖和蔗糖分別加入MS+BA 2.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L，pH值調節為5.8，每個處理重復3次。培養條件及調查方法同上1.2.3。

2 結果與分析

2.1 不同培養方式對白鶴芋組培苗增殖生長的影響

將白鶴芋組培苗分別進行固體培養基培養、間歇式液體培養基培養和接觸式液體培養基培養，分別培養40 d后進行白鶴芋組培苗增殖情況的調查。結果發現，在接觸式生物反應器中可生長出大量的單株外植體叢生芽，而且生長速度較快，狀態良好。

由表1可知，在接觸式生物反應器中可生長出大量的白鶴芋組培苗，獲得了株高6.41 cm、鮮物重40.90 g/L、干物重4.89 g/L和叢生芽數6.10，最多，間歇式生物反應器培養次之，固體培養的增殖效果最差，三者的單個外植體再生形成的芽的平均數存在極顯著差異;在白鶴芋組培苗增殖過程中，反應器中生長的組培苗一直保持旺盛的增殖生長，叢生芽數增加較為明顯，植株葉片顏色為鮮綠色，而固體培養白鶴芋組培苗增殖速度相對較慢，生長狀況良好。

表1 培養方法對白鶴芋組培苗增殖生長的影響

注：為0.05顯著水平的多重比較結果，下同。

2.2 接種量對白鶴芋組培苗增殖生長的影響

將40、50、60和70 個單株白鶴芋組培苗接種于3 L氣升式氣球型生物反應器內進行增殖培養，發現叢生芽在培養初期長勢緩慢，經15 d后，叢生芽分化和生長速度明顯加快。

從表2可知，生長40 d后，接種量為40個單株時，株高、叢生芽數、鮮物重和干物重明顯低于其它處理，接種量為60個單株時，各項指標明顯優于其它處理，株高6.29 cm，叢生芽數12，鮮物重65.25 g，干物重7.68 g。

表2 接種量對白鶴芋組培苗增殖生長的影響

2.3 通氣量對白鶴芋組培苗增殖生長的影響

反應器內通入適宜的氧氣有利于白鶴芋組培苗增殖生長。當通氣量為0.3 vvm時，所培養的白鶴芋組培苗不僅生長健壯，而且所有參數均顯著優于其它處理，株高、鮮物重和干物重達到最高值，分別為4.87 cm、41.76 g/L和3.98 g/L(表3)。當通氣量為0.1 vvm時，外植體的株高、鮮物重、干物重和叢生芽數等結果較差；通氣量為0.20和0.40 vvm處理中，組培苗顏色綠，葉片肥厚，但0.40 vvm處理中株高、叢生芽數、鮮物重和干物重等低于0.30 vvm處理。結果表明：通氣量為0.30 vvm最利于促進白鶴芋組培苗增殖，過低或過高都不適宜。

表3 通氣量對白鶴芋組培苗增殖生長的影響

2.4 碳源對白鶴芋組培苗增殖生長的影響

糖是植物組織培養中不可缺少的，它不但作為離體組織賴以生長的碳源，而且還能維持培養基滲透壓。本試驗調查了糖種類對白鶴芋組培苗增殖生長的影響。從表4可以看出，用蔗糖作為碳源時，株高、鮮物重和干物重略高于白糖處理，但差異不大，以白糖作為碳源處理時，獲得的叢生芽數明顯高于蔗糖。從外觀上看，2個處理對白鶴芋組培苗的生長無明顯差異，表明蔗糖和白糖均適用于白鶴芋組織培養。大規模生產時，需糖量巨大，為節約成本，可利用白糖代替蔗糖作為有效糖源。

表4 糖種類對白鶴芋組培苗增殖生長的影響

注：**為0.05顯著水平的獨立樣本t測驗結果。

3 討論與結論

植物組織培養是指通過無菌和人工控制的環境條件，利用適當的培養基，對離體的植物器官、組織、細胞及原生質體進行培養，使其再生細胞或長成完整植株的技術。其突出特點是生長周期短、繁殖系數高、能夠保持原種苗的優良性狀，同時培養條件可人為控制、管理方便、有利于工廠化生產。傳統的組織培養有固體培養和液體培養2種方式。固體培養最大的優點是操作簡便，通氣問題易于解決，便于觀察研究，但外植體與培養基接觸面積小，養分在培養基中擴散慢，影響吸收利用，培養物排出的代謝廢物對組織可產生毒害作用。本試驗打破傳統固體培養模式，優化為生物反應器液體培養，結果發現，應用接觸式生物反應器，能夠大量擴繁白鶴芋組培苗，節省了成本和操作時間，為大規模生產拓寬了思路。

在反應器培養中，接種量的多少對培養物的生長影響很大，接種量低，既浪費空間，又不利于植物生長；而接種量過高時，營養成分和氧氣不能被充分利用，植物生長受抑制，會加速植物的衰老死亡[10-11]。金美玉[12]，楊金鳳[13]研究發現，利用生物反應器培養葡萄，接種量過高或過低，均不利于葡萄組培苗增殖生長。本試驗中，接種量為60個單株，最適于白鶴芋組培苗在3 L(含2 L培養液)的反應器中培養。

在反應器中提供外源氧氣，可以給植物代謝活動提供充分的溶解氧，同時，可以充分攪動培養基，有利于培養物吸收營養成分[14]。金美玉[12]研究表明，通氣量0.15 vvm為葡萄生物反應器培養的最佳通氣量。在本試驗中，當通氣量為0.3 vvm時，培養的白鶴芋組培苗不僅生長健壯，而且所有參素均顯著優于其它處理。株高、鮮物重和干物重數達到最高值(4.87 cm、41.76 g/L和3.98 g/L)。

糖是植物組織培養成功與否的關鍵因素，至今為止，已有近50種糖類可用于植物組織培養，其中，蔗糖一直作為標準碳源，但許多研究表明，蔗糖并不一定是最佳碳源，其它糖類如葡萄糖、果糖、麥芽糖等對植物組織培養均有不同的良好表現[15]。糖濃度影響滲透壓和養分吸收，過高濃度的蔗糖可以產生較高含量的生物活性物質[16]，這可能是由于高滲透壓影響了分解代謝從而導致碳代謝途徑發生變化[17]。在不同碳源對草原櫻桃增殖和生根培養的研究中，蔗糖和白砂糖差異不顯著，而白砂糖的市售價較低，因此在生產中可以用白砂糖替代蔗糖作為碳源，又能達到降低成本的目的[18]。

本試驗結果表明，用蔗糖和白糖作為碳源，對白鶴芋在生物反應器中的培養狀況無明顯差異，為節約成本，從投入成本及外植體叢生芽數等綜合考慮，推薦白糖作為大規模生產白鶴芋組培苗增殖生長的最經濟有效的糖源。

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Effect of several factors on shoots growth and proliferation of Spathiphyllum floribundum in bioreactor

HAN Lu1, XIU Jingrun2, DAI Yue2, LIAN Meilan1, YIN Guanhao3, JIN Meiyu1*

(1.AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,YanjiJilin133002,China2.YanbianAcademyofAgriculturalSciences,LongjingJilin133400，China；3.Agro-TechExtensionandServiceCenterofYanbian,YanjiJilin133000,China)

In order to find a simple, low cost and large-scale production way for producingSpathiphyllumfloribundumshoots,Spathiphyllumfloribundumshoot (2 cm) as explant, several factors affecting on the growth ofSpathiphyllumfloribundumshoots were investigated. The results showed that raft culture in bioreactors was favorable for shoot growth with dark-green in leaf color, fresh weight and dry weight were higher than others. Meanwhile, 60 inoculation and air volume of 0.3 vvm were best for shoots proliferation. It is a cost-saving way for large-scale culture when white sugar selected as source of carbon for the growth ofSpathiphyllumfloribundumshoots.

Spathiphyllumfloribundum; tissue culture plants; inoculation density; air volume; Bioreactor

2016-10-15 基金項目：國家自然科學基金(30860176)； 2016年大學生創新創業訓練計劃項目(ydbksky2016343)

韓璐(1994—)，女，吉林松原人，在讀學士，研究方向為植物組織培養及反應器應用。金美玉為通信作者，

E-mail:jinmeiyu@ybu.edu.cn

1004-7999(2016)04-0313-04

10.13478/j.cnki.jasyu.2016.04.006

S682.19

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