樺褐孔菌酸性蛋白酶基因的克隆及其生物信息分析

李 健， 張宇婷， 安丹丹， 陳艷秋

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

樺褐孔菌酸性蛋白酶基因的克隆及其生物信息分析

李 健， 張宇婷， 安丹丹， 陳艷秋*

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

采用RACE法對樺褐孔菌JL01菌株的蛋白酶基因的cDNA全長序列進(jìn)行克隆，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明：本研究中克隆的目的基因的cDNA序列全長為1 178 bp，包含990 bp開放閱讀框(ORF)，編碼由329個(gè)氨基酸組成的蛋白(IO-AP)；IO-AP屬于胃蛋白酶超級家族的天冬氨酸蛋白酶家族，具有天冬氨酸類型蛋白內(nèi)切酶活性，是一種酸性蛋白酶。IO-AP與鮑姆桑黃菌(Sanghuangporusbaumii)的酸性蛋白酶(AP)的氨基酸序列一致性為88%，進(jìn)化關(guān)系最近；與地中海嗜藍(lán)孢孔菌(Fomitiporiamediterranea)的氨基酸序列一致性為85%；與其他來源AP的序列一致性均小于75%。

樺褐孔菌；酸性蛋白酶；RACE；克隆；序列分析

樺褐孔菌(Inonotusobliquus)，是一種非常珍貴的藥用真菌，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值；又稱為白樺茸、樺癌褐孔菌和斜生纖孔菌，主要分布在北緯45°～50°地區(qū)[1-4]；其藥用部分為菌核，呈瘤狀，無柄，直徑為25～40 cm，外表黑灰色，有不規(guī)則的溝痕及深裂，質(zhì)硬且脆[5]。

早在16世紀(jì)，樺褐孔菌就廣泛應(yīng)用于防治各種疑難雜癥，如腸癌、肝癌、胃癌等各種消化系統(tǒng)的癌癥及心臟病等[6]。近年來，諸多研究發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌提取物，如多糖、類固醇和三萜類化合物等，能夠防止癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，抑制多種腫瘤細(xì)胞，抑制HIV和SARS病毒，具有抗衰老、增強(qiáng)免疫能力等功效[7-11]。樺褐孔菌精粉因其能夠降低血糖，對糖尿病具有非常高的治愈率[12]。

蛋白酶是水解蛋白質(zhì)肽鍵的一類酶的總稱[13]。按其水解多肽的方式分成內(nèi)肽酶和端肽酶2類；按其催化活性中心的不同，又可分為絲氨酸蛋白酶、巰基蛋白酶、金屬蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶(又稱酸性蛋白酶)等4種[14]。在國外，對酸性蛋白酶研究的比較早，而且對曲霉酸性蛋白酶的結(jié)構(gòu)和功能等研究已較為透徹。1954年，吉田文彥在黑曲霉中就已發(fā)現(xiàn)酸性蛋白酶[15]。2001年，Togai等從假絲酵母(Candidatropicalis)分離出一種酸性蛋白酶，并對其進(jìn)行了核苷酸序列和功能分析[16]。我國對酸性蛋白酶的研究較晚，而且大多局限于生理、生化活性等方面，如王云等(2008年)通過質(zhì)譜指紋法對黑曲霉niger H發(fā)酵液中所產(chǎn)蛋白進(jìn)行了分析和鑒定，并對酸性蛋白酶進(jìn)行了分子生物學(xué)方面的研究[17]。1991年，鄭海歌等發(fā)現(xiàn)在草菇衰老階段蛋白酶的活性增加[18]，蛋白酶還影響盤基網(wǎng)柄菌蛋白質(zhì)的周轉(zhuǎn)、蘑菇幾丁質(zhì)的合成、真菌的自溶，特別是對裂褶菌、雙孢蘑菇、盤基網(wǎng)柄菌、平菇及香菇的子實(shí)體形成具有非常重要的作用。然而，目前有關(guān)樺褐孔菌酸性蛋白酶的分子生物學(xué)研究還未見報(bào)道。

樺褐孔菌的人工栽培中，雖然能夠產(chǎn)生菌核，但產(chǎn)量過低，嚴(yán)重限制其規(guī)模化生產(chǎn)[19]。據(jù)本課題組趙麗等(2011年)研究，菌核產(chǎn)量的增加伴隨著蛋白酶活性的上升，說明菌核的形成可能與蛋白酶有關(guān)[20]，本研究對樺褐孔菌蛋白酶基因進(jìn)行克隆，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為探明菌核發(fā)育與蛋白酶的關(guān)系、揭示樺褐孔菌菌核發(fā)育的分子機(jī)理奠定理論與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

樺褐孔菌菌株JL01，由采自吉林省汪清縣的野生樺褐孔菌菌核菌絲體分離而來，保存于延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院應(yīng)用真菌實(shí)驗(yàn)室。

1.2 克隆菌株及試驗(yàn)試劑

克隆菌株E.coliDH5α、TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV(RNase H-)、RNase Inhibitor、Oligo(dT)18、LATaq、DL 2 000 Marker、DL 5 000 Marker、氨芐青霉素和pMD18-T Simple Vector等購自大連寶生物有限公司；凝膠回收試劑盒(Gel Extraction Kit)購自O(shè)MEGA公司；SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒采購于Clontech公司；胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂糖、溴化乙錠(EB)等其它試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.3 總RNA提取

采用TRIzol法提取樺褐孔菌菌絲體的總RNA。利用核酸蛋白測定儀檢測提取的總RNA的純度。

1.4 簡并引物設(shè)計(jì)

在NCBI上下載與樺褐孔菌同屬的嗜藍(lán)孢孔菌和相近種屬菌株的酸性蛋白酶和金屬蛋白酶的氨基酸序列，利用Primer5軟件分別設(shè)計(jì)酸性蛋白酶的1對簡并引物(AP1和AP2)和金屬蛋白酶的1對簡并引物(MP1和MP2)(表1)。

表1 基因克隆使用的引物

1.5 目的基因的PCR擴(kuò)增

以總RNA通過反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，利用所設(shè)計(jì)的酸性蛋白酶基因和金屬蛋白酶基因的簡并引物，通過PCR擴(kuò)增得到目的基因的cDNA片段。再根據(jù)此片段設(shè)計(jì)2對特異性巢式引物(GSP1、GSP2和NGSP1、NGSP2)，采用3′-RACE和5′-RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)法擴(kuò)增，具體步驟按照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒的說明書進(jìn)行。將獲得的3′-RACE片段和5′-RACE片段在瓊脂糖凝膠上確認(rèn)后，送交測序公司測序；根據(jù)測序結(jié)果，針對目標(biāo)DNA全長序列設(shè)計(jì)1對全序克隆引物(APQC1和APQC2)，通過PCR擴(kuò)增目標(biāo)DNA全長序列，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)后，回收和純化目標(biāo)DNA片段、連接到pMD-18T克隆載體上、轉(zhuǎn)化DH 5ɑ，經(jīng)平板培養(yǎng)、挑取陽性單克隆、經(jīng)搖菌擴(kuò)增培養(yǎng)后，將菌液送交測序公司測序。

1.6 序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

利用DNAMAN軟件對目標(biāo)DNA全長序列進(jìn)行分析；利用MEGA6軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；使用InterProScan5在線工具分析目的蛋白的結(jié)構(gòu)域和功能域[21-25]；目的蛋白的理化特性利用ProtParam tool在線工具分析；目的蛋白信號肽利用SignalP 4.1 Server在線工具進(jìn)行預(yù)測；利用NCBI在線分析工具Conserved Domain Search Service (CD Search)對模塊進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶基因全長的克隆

以菌絲體的cDNA為模板，用簡并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，金屬蛋白酶未能獲得片段(圖1，第1泳道)，酸性蛋白酶獲得1條390 bp的中間片段(圖1，第2泳道)。5′-端獲得1條長度為861 bp的基因片段(圖1，第4泳道)，3′-端獲得1條長度為375 bp的基因片段(圖1，第3泳道)。cDNA全長測序結(jié)果表明，所得酸性蛋白酶基因的cDNA序列全長1 178 bp(圖1，第5泳道)。

M-DL2000 marker；1-金屬蛋白酶cDNA片段(未能擴(kuò)增出目標(biāo)片段)；2-酸性蛋白酶基因cDNA片段；3-3′-RACE產(chǎn)物；4-5′-RACE產(chǎn)物；5-酸性蛋白酶基因cDNA全長

圖1 蛋白酶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物

Fig.1 Amplified product of protease gene fromInonotusobliquus

2.2 序列分析

利用全序克隆引物擴(kuò)增目標(biāo)DNA片段獲得的產(chǎn)物(圖1，第5泳道)，回收、純化后連接到pMD-18T克隆載體上，再轉(zhuǎn)化DH 5ɑ并擴(kuò)增培養(yǎng)后，送菌測序(圖2)。結(jié)果表明，試驗(yàn)從樺褐孔菌菌絲體中獲得的酸性蛋白酶基因的cDNA序列全長1 178 bp，其序列中第25個(gè)堿基至第1 014個(gè)堿基之間，包含990 bp開放閱讀框(ORF)，編碼由329個(gè)氨基酸所組成的蛋白(該試驗(yàn)中，命名為InonotusobliquusAcid protease，簡稱IO-AP)；該cDNA序列的NCBI GenBank登錄號為KT724964.1，其ORF編碼的蛋白質(zhì)的NCBI GenBank登錄號為AOO94936.1。

圖2 酸性蛋白酶基因的全長cDNA序列及其ORF編碼的氨基酸序列

2.3 目的蛋白的理化特性及信號肽

利用在線分析工具ProtParam(http://web.expasy.org/)和SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對目的蛋白的理化特性和信號肽進(jìn)行分析(圖3)，結(jié)果表明，該蛋白分子量為34.6 k Da、理論等電點(diǎn)(pI)為4.23，無信號肽；其不穩(wěn)定系數(shù)Instability index (II)為20.91，小于40.0，屬于穩(wěn)定蛋白，以自由態(tài)存在。

2.4 目的基因的功能

利用NCBI在線分析工具Conserved Domain Search Service (CD Search)模塊進(jìn)行分析(圖4)，結(jié)果表明，本研究中克隆的目的基因編碼的蛋白是一種類胃蛋白酶超級家族的天冬氨酸蛋白酶(即，羧基蛋白酶)，屬于酸性蛋白酶(圖4A)。

圖3 目的蛋白(IO-AP)的理化特性及其信號肽

InterProScan5在線工具分析結(jié)果表明，該蛋白歸屬胃蛋白酶超級家族的天冬氨酸蛋白酶A1家族(圖4B)，含有天冬氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域、蛋白酶A1家族結(jié)構(gòu)域和天冬氨酸蛋白酶活性中心(第14～25和第198～209氨基酸殘基之間)，其生物學(xué)功能是參與蛋白質(zhì)水解、天冬氨酸類型蛋白內(nèi)切酶活性。

GO term prediction:1) Biological Process: GO:0006508 proteolysis；2) Molecular Function: GO:0004190 aspartic-type endopeptidase activity；3) Cellular Component: Non predicted

圖4 目的蛋白(IO-AP)的結(jié)構(gòu)域及其功能分析

Fig.4 Structural domain and biological function of the target protein (IO-AP)

2.5 目的蛋白的親緣關(guān)系

在NCBI上通過BLAST，對目的基因編碼的蛋白(IO-AP)的氨基酸序列進(jìn)行一致性搜索。。

由表2可知，IO-AP與來自其它真菌的酸性蛋白酶(acid protease, 簡稱AP)的氨基酸序列具有一致性；其中，IO-AP與來自鮑姆桑黃菌(Sanghuangporusbaumii)和地中海嗜藍(lán)孢孔菌(Fomitiporiamediterranea)的AP氨基酸序列一致性最高，分別為88%和85%；與來自Gloeophyllumtrabeum(密褐褶孔菌)、Stereumhirsutum(毛韌革菌)、Daedalea quercina(櫟迷孔菌)、Coniophora puteana(粉孢革菌)、Neolentinuslepideus(豹皮香菇)、Trametesversicolor(變色栓菌)和Peniophorasp.(隔孢伏革菌)的AP氨基酸序列一致性為68%～72%，均低于80%。

從利用13種不同來源的酸性蛋白酶(AP)所構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5)可知，來自13種不同真菌的AP蛋白，在進(jìn)化上分為2個(gè)大分枝，來自樺褐孔菌的IO-AP與來自鮑姆桑黃菌(Sanghuangporusbaumii)、地中海嗜藍(lán)孢孔菌(Fomitiporiamediterranea)和Coniophoraputeana(粉孢革菌)的AP位于同一分枝中，屬于傘菌綱真菌AP分枝(類群)；而來自其他9種傘菌綱真菌的AP則位于另一個(gè)不同的分枝中。相對而言，樺褐孔菌的IO-AP與鮑姆桑黃菌(Sanghuangporusbaumii)的AP在進(jìn)化上關(guān)系最近，其次是地中海嗜藍(lán)孢孔菌(Fomitiporiamediterranea)的AP，Coniophoraputeana(粉孢革菌)的AP在進(jìn)化上與樺褐孔菌的IO-AP關(guān)系較遠(yuǎn)。從圖5上看，圖中所涉及的13種不同真菌來源的AP中，除以上3種傘菌綱真菌的AP外，其他同屬傘菌綱的9種真菌的AP在進(jìn)化上關(guān)系很遠(yuǎn)。

表2 IO-AP與其他來源AP的氨基酸序列一致性

樺褐孔菌(AOO94936.1)；嗜藍(lán)孢孔菌(XP_007270786.1)；鮑姆桑黃菌(OCB89084.1)；粉孢革菌(XP_007769668.1)；密褐褶菌(XP_007866714.1)；密褐褶菌(XP_007866715.1)；韌黑傘(KJA23239.1)；裂褶菌(XP_003037073.1)；毛韌革菌(XP_007309157.1)；干朽菌(XP_007319879.1)；皺波褶尾菌(KII86690.1)；灰樹花(OBZ71216.1).

圖5 IO-AP蛋白與其他真菌AP蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹

Fig.5 Phylogenetic tree of IO-AP and other fungus AP proteins

3 討論

樺褐孔菌(Inonotusobliquus)作為一種藥用真菌[5]，在市場上需求量很大，但其野生來源非常有限，而且人工栽培受到其子實(shí)體產(chǎn)量不足的限制。在實(shí)踐中，如何提高樺褐孔菌子實(shí)體的產(chǎn)量，以滿足樺褐孔菌生產(chǎn)的需要，是亟待解決的問題。蛋白酶是一類水解蛋白質(zhì)肽鍵的酶[13]，它不僅通過蛋白質(zhì)的水解為生物體提供能量，而且為生物體的生長發(fā)育提供營養(yǎng)物質(zhì)。蛋白酶活性的消長與草菇衰老有關(guān)，而且與裂褶菌、雙孢蘑菇、盤基網(wǎng)柄菌、平菇及香菇的子實(shí)體形成有關(guān)[18]。另外，在樺褐孔菌中，也已被證實(shí)其子實(shí)體產(chǎn)量與蛋白酶活性也有關(guān)[20]。

酸性蛋白酶是4種蛋白酶之一，其生理、生化及分子生物學(xué)方面，在其他真菌中廣泛被研究[15-17]；但在樺褐孔菌中，迄今未見相關(guān)報(bào)道。為闡明蛋白酶與樺褐孔菌子實(shí)體形成的關(guān)系，該研究以其他真菌來源的酸性蛋白酶基因及其酶蛋白氨基酸序列為基礎(chǔ)，采用RACE法，嘗試從樺褐孔菌子實(shí)體中克隆出酸性蛋白酶基因。結(jié)果表明：從樺褐孔菌JL01菌株中分離的目的基因cDNA全長序列長度為1 178 bp，包含由990個(gè)堿基所組成的開放閱讀框(ORF)，編碼由329個(gè)氨基酸所組成的蛋白(被命名為IO-AP)；該cDNA序列的NCBI GenBank登錄號為KT724964.1，其IO-AP的NCBI GenBank登錄號為AOO94936.1。IO-AP分子量為 34.6k Da、理論等電點(diǎn)(pI)為4.23，無信號肽，是一種穩(wěn)定蛋白，在細(xì)胞質(zhì)中以自由態(tài)形式存在；對IO-AP的生物信息學(xué)分析表明，IO-AP屬于類胃蛋白酶超級家族的天冬氨酸蛋白酶(即，羧基蛋白酶)A1家族，是一種酸性蛋白酶，其生物學(xué)功能是參與蛋白質(zhì)水解，具有天冬氨酸類型蛋白內(nèi)切酶活性。IO-AP在進(jìn)化上與傘菌綱真菌的鮑姆桑黃菌(Sanghuangporusbaumii)AP關(guān)系最近，其次為傘菌綱真菌地中海嗜藍(lán)孢孔菌(Fomitiporiamediterranea)AP和粉孢革菌(Coniophoraputeana)AP，在進(jìn)化樹中位于同一分枝中；而其他同屬于傘菌綱的9種AP則位于完全不同的另一個(gè)分枝中，與IO-AP進(jìn)化關(guān)系很遠(yuǎn)。

總之，該研究采用RACE法，從樺褐孔菌JL01菌株子實(shí)體中克隆出了樺褐孔菌子實(shí)體酸性蛋白酶基因cDNA全長序列，并對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析[26-28]，為揭示樺褐孔菌子實(shí)體發(fā)育與酸性蛋白酶的關(guān)系及其菌核發(fā)育的分子機(jī)理奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Cloning and its bioinformatics analysis of acid protease gene from Inonotus obliquus

LI Jian, ZHANG Yuting, AN Dandan, CHEN Yanqiu*

(AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,YanjiJilin133002,China)

In this study, the full-length cDNA sequence of the protease gene fromInonotusobliquusJL01 was cloned and its bioinformatics analysis was conducted. The results showed that the full-length cDNA sequence of the target gene was 1 178 bp containing a 990 bp-ORF encoding a protein (IO-AP) comprising of 329 amino acids. IO-AP was an acid protease involving aspartic-type endopeptidase activity, belonged to aspartic peptidase A1 family of pepsin-retropepsin-like superfamily. IO-AP fromInonotusobliquusrevealed a 88% identity in amino acid sequence with the AP fromSanghuangporusbaumii, a 85% identity with the AP fromFomitiporiamediterranea, whereas the identities of IO-AP fromInonotusobliquuswith the other APs were all less than 75%.

Inonotusobliquus; acid protease; RACE; cloning; sequence analysis

2016-09-27 基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31160408和31460536)

李健(1990—)，男，吉林長春人，在讀碩士，研究方向?yàn)樯锛夹g(shù)在食藥用真菌中的應(yīng)用。 陳艷秋為通信作者，

E-mail:cyq326@126.com

1004-7999(2016)04-0292-08

10.13478/j.cnki.jasyu.2016.04.003

S567.39

A