雞爪苓菌絲體與子實體的全長cDNA文庫構建及部分EST序列分析

蔣雨函, 許廣波, 梁運江, 李太元, 李美善, 李艷茹

(延邊大學農學院，吉林 延吉 133002)

雞爪苓菌絲體與子實體的全長cDNA文庫構建及部分EST序列分析

蔣雨函, 許廣波, 梁運江, 李太元, 李美善, 李艷茹*

(延邊大學農學院，吉林 延吉 133002)

構建長白山藥用真菌雞爪苓菌絲體和子實體cDNA文庫并測序，發掘雞爪苓菌絲體和子實體發育中差異表達的基因；通過同源性比對，分析與陜西豬苓的親緣關系，確立長白山雞爪苓的分類地位。結果表明：雞爪苓菌絲體和子實體cDNA文庫滴度分別為1.504×1010pfu/mL和1.094×1010pfu/mL。從菌絲體cDNA文庫選取500個克隆，經測序獲得452個高質量表達序列標簽(EST)，序列拼接出的單一基因簇包含310個單一基因；從子實體cDNA文庫中選取的500個克隆，經測序獲得472個高質量表達序列標簽，序列拼接出的單一基因簇包含350個單一基因。從菌絲體和子實體cDNA文庫中發掘的單一基因簇中，分別有39.3%和35.4%的基因與已知功能基因具有同源性，這些基因涉及細胞生長、信號轉導、蛋白質合成、轉錄、抗逆反應以及能量代謝等。

雞爪苓；全長cDNA文庫；表達序列標簽；功能注釋

豬苓(Polyponusumbellatus(Pers.) Fr)是一種藥用真菌，分地下生長的菌核和露出地表的子實體2部分[1]。我國陜西、云南、四川等省和東北長白山區是豬苓主要分布區域。從菌核的形態上可把豬苓劃分為豬苓和雞爪苓；豬苓菌核體形較大、形似豬糞、分枝少、表面較光滑；而雞爪苓菌核塊細小，形似雞爪、分枝多、呈餅狀[2-5]。Xing等(2013年)[6]對產自吉林長白山和陜西秦嶺的豬苓菌核進行了 nrDNA ITS 和 28S rRNA(LSU)序列的比對分析，認為產于長白山的雞爪苓和產于陜西等地的豬苓之間存在種內遺傳差異，提出長白山雞爪苓應列為單獨類群。

表達序列標簽(Expressed sequence tags，EST)是從已構建的cDNA文庫中隨機選擇克隆，進行5′-端和3′-端測序獲得的短片段cDNA序列，是一個完整基因的一小部分[7-9]。廖鏖等(2014年)[10]和欒換東等(2015年)[11]對雞爪苓菌絲體和子實體分別進行了cDNA文庫構建，并在Nr/Nt數據庫中進行了Blast初步分析，找到了一小部分同源性基因。目前，關于豬苓cDNA文庫構建和EST序列分析方面的研究還很少，在NCBI數據庫可查尋的豬苓EST只有264條。

本研究擬在構建雞爪苓菌絲體和子實體2個生長階段的高質量全長cDNA文庫的基礎上，通過測序獲得表達序列標簽，并對其進行功能注釋，為闡明雞爪苓菌絲體和子實體2個生長發育中基因表達的差異、發掘參與雞爪苓菌絲體生長發育與子實體發生相關的重要基因奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

雞爪苓菌絲體由采自吉林省安圖縣的雞爪苓菌核經組織分離后培養獲得，經純化擴繁后保存于延邊大學微生物實驗室。雞爪苓子實體采自吉林省蛟河市天南鄉解放村，新鮮的子實體經冷藏保鮮帶回實驗室后用液氮冷凍處理備用。

1.2 雞爪苓菌絲體和子實體全長cDNA文庫的構建及其測序

菌絲體和子實體總RNA的提取參照 Trizol reagent 說明書進行操作；用改進的SMARTTM法[12]合成cDNA，通過LD-PCR擴增cDNA；經蛋白酶K消化、Sfi I酶切和CHROMA SPIN-400分級分離cDNA和構建雞爪苓菌絲體和子實體全長cDNA文庫。用 λ Triple × 2噬菌體包裝，統計菌落總數和藍白菌落數，對原始文庫進行文庫滴度和重組率的測定。再分別從菌絲體和子實體cDNA文庫中各隨機挑取500個克隆送至上海生工生物工程股份有限公司(長春分公司)進行測序。

1.3 EST序列的預處理

利用Chromas軟件分析cDNA序列峰圖，手動去掉800 bp下游序列部分；再利用NCBI網站中的VecScreen工具快速去除cDNA中的載體序列部分后，再使用Seqman程序對有效序列進行聚類拼接。

1.4 EST的功能注釋

將聚類拼接得到的EST有效序列，利用NCBI網站的核酸庫Nt和蛋白庫Nr進行BLASTN或BLASTX比對，E值設為1e-5。使用GO(Gene Ontology，基因本體論)數據庫對雞爪苓菌絲體和子實體全長cDNA文庫的EST進行功能分類注釋，獲得分子功能、生物學過程和細胞組分等3方面的注釋信息。

1.5 系統進化樹構建

雞爪苓系統進化樹的構建，采用MEGA6.05軟件中的NJ法。

2 結果與分析

2.1 雞爪苓菌絲體和子實體全長cDNA文庫的質量鑒定

構建的雞爪苓菌絲體和子實體全長cDNA文庫，經測定，菌絲體的cDNA原始文庫滴度為1.66×106pfu/mL，重組率為96.7%；擴增后，文庫的滴度為1.50×1010pfu/mL，插入片段長度主要在500～2 000 bp(圖1)。子實體的cDNA原始文庫滴度為5. 63×106pfu/mL，重組率為98.7%；擴增后文庫的滴度為1. 10×1010pfu/mL，插入片段長度主要在500～2 000 bp(圖2)。說明構建的雞爪苓菌絲體和子實體全長cDNA文庫均達到建庫的預期標準。

M：DNA分子量標準；1-23：分別為文庫中隨機挑選出來的克隆

M：DNA分子量標準；1-24：分別為文庫中隨機挑選出來的克隆

2.2 測序

從雞爪苓菌絲體和子實體cDNA文庫中分別隨機挑選500個克隆進行單向測序，共獲得452和472條高質量序列，平均長度為561和555 bp(表1)。

表1 菌絲體和子實體cDNA文庫的ESTs

Table 1 ESTs from cDNA library of mycelium and fruit body

描述項數目菌絲體子實體ESTs總數/條500500 空載體序列/條251 低質量序列/條2327 有效的ESTs/條452472有效ESTs平均長度/bp561555包含contigs的ESTs數目/條207201重疊群/條6579單拷貝EST/條245271單基因簇/條310350冗余度/%3126

通過聚類并對同一重疊群進行拼接，菌絲體文庫中一共獲得了65個含1條以上EST的重疊群和245條僅含1條EST的單一序列，即代表了310條單基因簇，文庫的冗余度為31%；子實體文庫中一共獲得了79個含1條以上的EST的重疊群和271條僅含1條EST的單一序列，即代表了350條單基因簇，文庫的冗余度為26%。

2.3 EST序列注釋

按高瑞娟(2003)、[13]崔永蘭(2004)[14]、cason等(2002)[15]和Crookshankst等(2001)[16]的EST序列注釋法，根據BLAST所得序列一致性，將EST劃分為3大類，E值 < 10-5且編碼己知蛋白的屬于“功能己知基因”類 ；編碼推測的和未知蛋白質的EST屬于功能未定的“假定蛋白質” 類 ； 而E值>10-5及注釋結果為缺乏顯著相似性的EST被認為是可能的新基因片段，納入“無顯著相似性”基因(表2)。

表2 EST的BLAST搜索及其同源蛋白分類

功能已知基因其功能涉及細胞生長、信號轉導、蛋白質合成、轉錄、抗逆反應以及能量代謝，選擇覆蓋率95%以上或95%的EST列入表中(表3，4)。

對基因的功能注釋結果表明，雞爪苓菌絲體和子實體全長cDNA文庫中參與蛋白質合成和能量代謝的基因較多，而且同源物種多數為真菌。

表3 已知功基因同源的菌絲體ESTs

表4 已知功基因同源的子實體ESTs

續表4 已知功基因同源的子實體ESTs

2.4 基因功能分類

雞爪苓菌絲體的基因GO注釋結果見圖3。

由圖3可知，僅有175條獲得1條或1條以上GO術語，包括細胞組分、分子功能和生化過程3個層次。細胞組分包括8個部分，分子功能包括2個部分，生化過程包括17個部分。雞爪苓子實體的基因GO注釋結果，僅有188條獲得1條或1條以上GO術語，亦包括細胞組分、分子功能和生化過程3個層次。細胞組分包括6個部分，分子功能包括3個部分，生物學過程包括19個部分(圖3)。在細胞組分(cellular component)中，菌絲體在包膜(envelope)和細胞器(organelle part)上單獨表達，子實體在胞外部分(extracellular region part)上單獨表達。在分子功能(molecular function)中，子實體在輸送體(transporter)上單獨表達。在生化過程中(biological Process)中，子實體在生物附著(biological adhesion)和生長(growth)上單獨表達。可見，雞爪苓在菌絲體和子實體的2個生長階段存在著基因表達上的差異。

圖3 雞爪苓菌絲體和子實體基因的GO功能注釋

2.5 雞爪苓的進化親緣關系

從雞爪苓的系統進化關系(圖4)來看，長白山雞爪苓(chicken-claw-shapedPolyporusumbellatus)與云芝(TrametesversicolorFP-101664SS1)、革菌(PunctulariastrigosozonataHHB-11173SS5)、污叉絲孔菌(DichomitussqualensLYAD-421SS1)和灰蓋傘菌(Coprinopsiscinereaokayama7*130)的進化關系較近；而陜西豬苓(Polyporusumbellatus)和立枯絲核菌(RhizoctoniasolaniAG-1IA)的進化關系較近。雖然長白山雞爪苓與陜西豬苓在傳統分類學上都劃歸豬苓，但本研究中所構建的系統進化樹中處于不同的遞進分枝中(圖4)；說明長白山雞爪苓和陜西豬苓在進化上存在較大分化，2者之間在遺傳上存在較大差異。

圖4 不同真菌系統進化樹

3 討論與結論

亞種通常是一個物種因地理隔離導致缺乏基因流所致，若進一步分化，甚至成為新的物種。從系統進化關系來看(圖4)，長白山區雞爪苓和陜西豬苓分別位于不同的分枝中，長白山區雞爪苓菌與云芝、革菌、污叉絲孔菌及灰蓋傘菌在進化上關系較近，而與陜西豬苓在進化上關系較遠，這與Xing等(2013)的研究結果一致。說明雞爪苓是長白山區特異的豬苓種質資源，不僅在菌核形態上與陜西豬苓差別很大，而且在遺傳上也存在較大差異。

本研究成功構建了雞爪苓菌絲體和子實體2個cDNA文庫，分別獲得452和472條高質量EST序列，并分別發掘出310和350條單一基因(unigene)。在菌絲體文庫中267條單一基因和子實體文庫中316條單一基因與NCBI數據庫中的相關基因有同源性；但有13.9%的雞爪苓菌絲體單一基因(43個)和9.7%的雞爪苓子實體單一基因(34個)在NCBI公共數據庫中未能搜索到與之相關的基因。由于NCBI數據庫中包含的基因數量和信息量非常龐大，本研究中所發掘的未知基因很有可能是雞爪苓特異表達的基因，在雞爪苓生長過程中具有重要功能。總之，目前在共享生物信息數據庫中關于豬苓的基因和基因組序列信息相對較少，本研究通過EST分析結果進一步豐富了雞爪苓基因組信息，為全面了解雞爪苓菌絲和子實體形成的分子機制奠定了理論與實驗基礎。

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Construction and EST sequence analysis of full-length cDNA library of mycelia and fruit body of medicinal fungus chicken-claw-shaped Polyporus umbellatus in the Changbai Mountain area

JIANG Yuhan, XU Guangbo， LIANG Yunjiang， LI Taiyuan， LI Meishan， LI Yanru*

(AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,YanjiJilin133002,China)

The cDNA library from the mycelia and fruit body of medicinal fungus chicken-claw-shapedPolyporusUmbellatusin Changbai Mountains was constructed and sequenced, and the genes differentially expressed between mycelium and fruit body were explored.In addition, by homologous analysis, its genetic relationship to ShǎnxiPolyporusUmbellatuswas determined and, its taxonomical status was established. The results showed that the titers for cDNA libraries of mycelium and fruit body were 1.504×1010pfu/mL and 1.094×1010pfu/mL,respectively. A total of 500 clones randomly selected from the cDNA library of mycelium producted 452 high quality ESTs and, from which 310 unigenes were annotated, whereas a total of 500 clones randomly selected from the cDNA library of fruit body produced 472 high quality ESTs and, from which 350 unigenes were annotated. Among the unigenes from cDNA libraries of mycelium and fruit body, approximately 44.5% and 42.6% of unigenes were homologous to the known genes concerned with cell development, signal transduction, protein synthesis, transcription, tolerance response to stress and energy metabolism.

chicken-claw-shaped polyporus umbellatus；cDNA library；EST；annotation

2016-10-20 基金項目：國家自然科學基金項目(31160014)

蔣雨函(1993—)，女，吉林四平人，在讀碩士，研究方向為藥用真菌學。李艷茹為通信作者，

E-mail：gbxu@ybu.edu.cn

1004-7999(2016)04-0277-06

10.13478/j.cnki.jasyu.2016.04.001

S567.3

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