大連蜈蚣藻孢子發育及生活史的研究

賈瀟博, 姜 朋, 周汝金, 關 云, 王宏偉

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大連蜈蚣藻孢子發育及生活史的研究

賈瀟博, 姜 朋, 周汝金, 關 云, 王宏偉

(遼寧師范大學生命科學學院, 遼寧大連 116081)

在實驗室條件下, 對大連蜈蚣藻(H.W.Wang et D.Zhao)的孢子早期發育、盤狀體的形成和直立枝生長進行了詳細研究, 對其生活史進行了詳細觀察, 并進行了溫度和光照強度對孢子發育影響的研究。結果表明: (1)孢子發育類型為間接盤狀體型; (2)生活史由雌、雄配子體、四分孢子體和果孢子體三相世代組成, 配子體與孢子體形態相同, 屬于同型世代交替, 與屬模蜈蚣藻(.)一致; (3)溫度對盤狀體和直立枝生長均有影響, 最適溫度均為16℃; (4)光照強度對盤狀體和直立枝生長均有影響, 最適光照強度分別為7 500 lx和10 000 lx。

大連蜈蚣藻(H.W.Wang et D.Zhao); 孢子發育; 生活史; 溫度; 光照強度

大連蜈蚣藻(H.W.Wang et D.Zhao)隸屬于紅藻門(Rhodophyta)、(Gigartinales)、海膜科(Halymeniaceae)、蜈蚣藻屬(C.Agardh), 是本課題組基于形態觀察和L基因序列分析發現并報道的產自遼寧省大連市的一個新種。藻體紫紅色, 直立, 高15~30 cm, 質軟, 單生或叢生, 基部具有盤狀固著器。主枝扁壓狀, 1~2回羽狀分枝, 小枝對生或偏生, 葉片細條狀, 單條或叉狀, 藻體頂端及基部均有小育枝, (圖1)。藻體橫切面觀: 由皮層及髓部組成。皮層由4~6層細胞組成, 厚度為60~80 μm, 分為外皮層和內皮層。外皮層細胞為長橢圓形或橢圓形, 長3~4 μm, 寬1~3 μm, 2~6層背斜排列; 內皮層細胞為橢圓形或不規則形狀, 長6~14 μm, 寬6~10 μm。中央髓絲錯綜交織, 長10~40 μm, 寬2~5 μm。生長于中、低潮帶的巖石或石沼中[1]。

目前關于大連蜈蚣藻的研究只限于有關新種的描述和報道, 關于孢子、盤狀體和直立枝的生長發育、生活史、有關環境因子對該藻的發育影響及經濟價值等均未報道。為了補充該藻的相關信息, 作者詳細研究了孢子的早期發育、盤狀體的形成及其類型和直立枝的生長, 探討了溫度和光照強度對其生長發育的影響, 明確了生活史構成, 豐富了大連蜈蚣藻早期發育和生活史的相關資料, 為大連蜈蚣藻的種質保存、人工養殖和可持續性開發利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 標本采集

用于培養的大連蜈蚣藻于2012 年7月27日采集于大連市付家莊低潮帶石沼中, 將帶有成熟四分孢子囊的四分孢子體和帶有成熟囊果的雌配子體置于盛有海水的保溫箱中, 活體帶回實驗室。

1.2 方法

1.2.1 材料處理

將天然海水過濾、滅菌, 冷卻后用于實驗。

使用解剖針和軟毛刷去除四分孢子體和雌配子體表面附著物, 再使用滅菌海水將其沖洗數次。處理后藻體分別放置于已滅菌并鋪滿載玻片的玻璃缸(20 cm×10 cm×10 cm)中, 倒入滅菌海水并充氣進行暫養, 暫養條件為溫度16℃、光照強度10 000 lx, 光周期為光(L)︰暗(D)＝12︰12。經過24h暫養, 取出載玻片于顯微鏡下觀察, 待視野中(10×10倍)孢子附著量達到20~30個時, 將其分別放入滅菌后的D15 cm培養皿中并編碼, 倒入PES培養液(每1 000 mL的培養液中加2 mg GeO2, 防止硅藻生長)至培養皿2/3體積處, 將培養皿放置于光溫控制的培養箱中持續培養, 培養過程中每3天更換1次培養液。

1.2.2 實驗設計

溫度組試驗: 溫度設置為4、8、12、16、20、24、30℃共7個梯度, 光照強度設置為10 000 lx, 光周期為L︰D＝12︰12。

光照強度組試驗: 光照強度設置為3 500、5 500、7 500、10 000、12 500、14 500、16 500 lx共7個梯度, 溫度設置為16℃, 光照周期為L︰D=12︰12。

1.2.3 觀察方法與分析

培養期間每2天一次取出載玻片觀察孢子萌發情況, 當盤狀體表面萌發出直立枝后, 將其轉移至滅菌的培養缸(10 cm×10 cm×5 cm)中, 進行成熟培養。

用Olympus BH2數碼相機(Olympus Beijing Co.Ltd., China)照相保存, 每周每組隨機抽取10個盤狀體測量直徑一次, 盤狀體相對生長速率利用公式GR(%/d)=(lnW–ln0)/×100%求得, 公式中0表示初始盤狀體直徑,是培養的天數(d),W表示培養天后的盤狀體直徑。直立枝的相對生長速率的計算與盤狀體相同。

2 結果

2.1 大連蜈蚣藻孢子(果孢子)的發育

雌配子體皮層內形成囊果, 突出于藻體表面, 直徑約0.3~0.4 mm(圖 2a)。室溫條件下, 培養約24 h, 藻體放散出微紅色果孢子, 直徑為10~20 μm, 附著于載玻片上(圖 2b)。經過12 h, 果孢子的一端開始膨脹并形成突起, 突起逐漸伸長, 形成萌發管, 顏色較果孢子稍淺(圖 2c)。萌發管伸長過程中, 細胞內容物逐漸移向萌發管一端, 當細胞內容物變空時, 萌發管與剩下的空膜之間產生隔膜, 致使萌發管頂端膨大, 形成基本細胞(圖 2d)。48 h左右基本細胞開始分裂, 3~4天后分裂成不規則狀盤狀體, 呈紫紅色(圖 2e)。培養到第25天左右, 盤狀體直徑超過200 μm, 并逐漸停止生長(圖 2f)。繼續培養, 盤狀體表面會隆起若干直立枝(圖 2g~h)。該直立枝不斷分裂生長, 長度不斷增大, 培養到第60天左右, 幼苗長度可達1 mm左右(圖 2i)。

a. 藻體表面囊果; b. 果孢子; c. 萌發管; d. 基本細胞形成; e. 形成盤狀體; f. 盤狀體的擴大; g~h. 直立枝的形成及生長; i. 幼苗

a. algae surface capsule; b. fruit spores; c. germination tube; d. basic cell formation; e. formation of the disk-like body; f. disk-like body expansion; g–h. erect branches of the formation and growth; i. seedlings

四分孢子由四分孢子體孢子囊壁溶解后放散出, 發育情況與果孢子基本一致。

2.2 大連蜈蚣藻的生活史

圖3所示為大連蜈蚣藻生活史。大連蜈蚣藻配子體為雌、雄異體, 雄配子體外皮層上形成精子囊, 精子囊聚集成群, 成熟后釋放精子。雌配子體內皮層細胞分化生成了輔助細胞枝生殖枝叢和果胞枝生殖枝叢, 果胞枝生殖枝叢主枝由7~10個橢圓形細胞組成, 為果胞枝, 其上帶有1~4個側枝, 每個側枝亦由5~11個細胞組成, 末端細胞為果胞, 不分枝, 其上有一條長形受精絲, 其下為下位細胞; 輔助細胞枝生殖枝叢主枝由7~15個近圓形細胞組成, 為輔助細胞枝, 其上有2~4個分支, 末端細胞為輔助細胞, 每個分支亦由4~9個細胞組成, 輔助細胞個體大, 原生質較濃, 顏色較深[1]。游離的精子通過受精絲與果胞結合, 形成合子, 受精完成后, 果胞與下位細胞融合產生聯絡絲, 合子通過聯絡絲與輔助細胞相結合, 融入合子的輔助細胞分離出一個簡單的產孢絲, 并不斷成熟為果孢子囊, 同時營養絲與周圍的髓絲混雜, 圍繞果孢子囊形成一個絲狀囊果被, 并與果孢子囊一起形成近球形的囊果(果孢子體), 直徑為200~290 μm, 成熟的囊果埋藏于皮層下, 囊果中央形成一個囊果孔, 囊果散生在藻體上。果孢子通過囊果孔釋放出來, 孢子發育并形成盤狀體, 生長到一定階段的盤狀體會萌發出直立枝, 直立枝生長成幼苗并不斷發育成成熟的四分孢子體。

四分孢子體成熟后分化出四分孢子囊, 四分孢子囊成熟后長34~56 μm, 寬12~24 μm。經減數分裂, 形成4個四分孢子, 其外形相同, 但有性別分化, 成熟后脫離母體, 其萌發與果孢子類似, 分別萌發成雌、雄配子體。

大連蜈蚣藻的生活史, 由同型的配子體、四分孢子體和果孢子體三相世代組成, 配子體和四分孢子體外形一致, 交替出現, 為典型的同型世代交替。

2.3 溫度對孢子(果孢子)發育的影響

圖4為不同溫度下盤狀體生長情況。溫度為4℃時, 果孢子不萌發; 溫度為8℃時盤狀體生長緩慢, 第28天時的直徑僅為190 μm, 相對生長速率為4.91%;溫度為12℃時盤狀體增長較快, 第28天時的直徑達到210 μm, 相對生長速率為7.15%; 溫度為16℃時, 盤狀體直徑增長最快, 初始盤狀體直徑達超過40 μm, 第28天時盤狀體直徑接近250 μm, 相對生長速率為7.37%; 溫度升高, 盤狀體又開始生長緩慢, 第28天時, 20℃下的相對生長速率為6.14%, 24℃時為3.46%; 溫度為30℃時, 果孢子不萌發。方差分析表明, 溫度對盤狀體生長的影響差異顯著(<0.05), 且最適溫度為16℃。溫度為12~16℃時盤狀體生長較好, 影響其生長的優劣順序為16℃>12℃>20℃> 8℃>24℃。

圖5為不同溫度下直立枝生長情況。溫度為8℃時, 盤狀體上無法萌發出直立枝; 溫度為12℃時, 直立枝生長緩慢, 第58天時的長度僅為480 μm, 相對生長速率為8.88%, 溫度為16℃時, 直立枝生長最快,第58天時的長度超過1 000 μm, 相對生長速率達到10.60%, 溫度為20℃時, 直立枝生長較快, 第58天時相對生長速率達到10.21%; 溫度為24℃時, 直立枝無法萌發出。方差分析表明, 溫度對直立枝生長的影響同樣差異顯著(<0.05), 且最適溫度為16℃。直立枝適宜生長溫度為16~20℃, 溫度影響其生長關系為16℃>20℃>12℃。

溫度影響四分孢子發育實驗中, 與果孢子相一致。

2.4 光強對孢子(果孢子)發育的影響

不同光強下的盤狀體在培養初期生長差距不明顯, 繼續培養, 各個時間段上的生長差距逐漸加大(圖6)。光強為3 500 lx時, 盤狀體生長抑制明顯, 發育緩慢; 光強為5 500~12 500lx時, 盤狀體生長較好, 培養28天時的盤狀體計算相對生長速率, 5 500 lx時為6.32%, 7500 lx時為9.72%, 10 000 lx時為7.89%, , 12 500 lx時為3.34%; 光強為14 500~16 500 lx時, 盤狀體培養到后期大量死亡。單因素方差分析表明, 光強對盤狀體生長的影響差異顯著(<0.05), 最適光強為7 500lx。適宜光照強度為7 500~10 000 lx。

光強對直立枝生長影響見圖7。光強為3500 lx時, 盤狀體上無直立枝萌發; 光強為5 500lx, 直立枝生長緩慢, 相對生長速率為9.12%, 光強為7 500~ 10 000 lx時, 直立枝生長較快, 相對生長速率分別為10.91%和11.58%; 光強升到12 500 lx時, 直立枝的生長又變得緩慢, 相對生長速率僅為9.55%; 光強為14 500 lx時直立枝萌發緩慢; 光強為16 500lx時直立枝不萌發。方差分析表明, 光強對直立枝生長的影響差異顯著(<0.05), 且最適光強為10 000 lx。結果表明, 適宜光強范圍為7 500~10 000 lx, 影響直立枝發育順序為10 000 lx>7 500 lx>12 500 lx>5 500 lx>14 500 lx。

光強影響四分孢子發育實驗中, 與果孢子相一致。

3 討論

孢子的發生類型、形態、大小等生物學特征是研究紅藻分類的依據[2], 通過觀察發現, 大連蜈蚣藻的四分孢子和果孢子發育類型一致, 孢子發育后, 基本細胞原位分裂形成盤狀體或基本細胞先分裂形成絲狀體后再形成盤狀體, 可見大連蜈蚣藻孢子發育類型為間接盤狀型, 與豬野俊平[2]研究的蜈蚣藻(.Lamouroux C.Agardh)(現為.Kawaguchi et Wang)、劉鳳賢等[3]研究的蜈蚣藻(.)與繁枝蜈蚣藻()、曹翠翠等[4]研究的細弱蜈蚣藻(.)孢子發育類型一致。培養中觀察到, 盤狀體在密集區域發生融合現象, 融合后的盤狀體邊緣顏色較淺, 中央部分較深, 顯微鏡下觀察到盤狀體中央凸起。數個盤狀體相互融合, 使其固著能力增強, 尤其在自然條件下, 可有效抵御水流對固著器的沖刷, 有利于幼苗生長, 此現象也常見于其他紅藻[5-7]。

研究發現, 大連蜈蚣藻生活史由同型的配子體、四分孢子體和果孢子體三相世代組成, 其中配子體由四分孢子發育而成, 四分孢子體由果孢子發育而成, 果孢子體則由配子體受精后的合子發育而成, 以寄生狀態生長在雌配子體里。整個生說史過程中, 配子體和四分孢子體交替出現, 為典型的同型世代交替, 與蜈蚣藻屬的模式種蜈蚣藻(.)生活史類型相同[8], 也與其他蜈蚣藻生活史類型相同[9-10]。通過研究其生活史, 進一步確定了大連蜈蚣藻的分類學地位。

溫度影響海藻的生長發育, 很多的研究結果都支持這一結論[11-13]。作者在實驗中發現盤狀體和直立枝生長的最適溫度相同, 均為16℃, 這與其在大連海域春天萌發時海水溫度極為接近, 但在適宜溫度范圍上有差異, 盤狀體生長的適宜溫度范圍為12~16℃, 直立枝為16~20℃, 這表明適宜直立枝生長的水溫范圍要高于盤狀體。但盤狀體和直立枝在低溫(8℃以下)和高溫(24℃以上)情況下不發育或生長受到明顯抑制, 這說明低溫和高溫均不利于其生長。蜈蚣藻屬不同種類孢子發育的適宜溫度各不相同, 如細弱蜈蚣藻(.)的盤狀體和直立枝生長的最適溫度為24℃[4], 舌狀蜈蚣藻(.)盤狀體生長最適溫度為25℃[6], 蜈蚣藻(.)和帶形蜈蚣藻(.)盤狀體在溫度高過20℃時生長較好[14]。大連蜈蚣藻的盤狀體和直立枝在溫度16℃時發育最好, 明顯低于蜈蚣藻屬其他種, 這很可能是孢子對環境適應的結果, 大連春季海面溫度15℃左右, 與實驗結果的最適溫度相一致。

光照強度是影響海藻生長的重要環境因子[15-16]。同樣, 大連蜈蚣藻盤狀體和直立枝的生長也受光照強度的影響。培養中作者發現, 盤狀體和直立枝最適光強不同, 盤狀體生長最適光照強度為7 500 lx, 直立枝為10 000 lx, 光照強度為7 500~10 000 lx時, 盤狀體和直立枝均發育較好。盤狀體在高光強和低光強下生長緩慢、顏色淺淡, 部分孢子無法發育成盤狀體且培養后期盤狀體大量死亡, 無法萌發出直立枝; 直立枝在高光強和低光強下同樣生長緩慢, 與最適光照強度下生長的直立枝大小相差明顯。自然環境下大連蜈蚣藻生長于低潮帶石沼中, 暴露在強光照下時間較短, 過高光強能顯著抑制其生長, 而低光照同樣不利于其光合作用。

蜈蚣藻屬藻類種類豐富、分布廣泛[8], 很多種類具有較好的醫用價值[17-18]、食用價值[19]和工業用途[20], 相信大連蜈蚣藻也具有同樣的價值, 所以對大連蜈蚣藻孢子、盤狀體、直立枝的生長發育和生活史的研究具有重要意義。有關大連蜈蚣藻的室內育苗以及各種環境因子對其影響的研究正在進行中。

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A study of the spore development and life cycle ofH.W. Wang and D. Zhao (Halymeniaceae, Rhodophyta)

JIA Xiao-bo, JIANG Peng, ZHOU Ru-jin, GUAN Yun, WANG Hong-wei

(College of Life Sciences, Liaoning Normal University, Dalian 116081, China)

The effects of temperature and light intensity on the growth of discoid crusts and upright thalliofwere investigated in the laboratory. We also observed in detail the development of spores, discoid crusts, and upright thalli, and the life cycle of each stage of the development process. The results showed: (1) The type of spore development was the “mediate discal type.” (2) The life cycle was the three-phase generations of the homotypic gametophyte, tetrasporophyte, and carposporophyte. The gametophyte and tetrasporophyte were morphologically identical and appeared alternately, consistent with those of. (3) The growth of discoid crusts and upright thalli was affected by temperature, and the optimum temperature was 16℃. (4) The growth of discoid crusts and upright thalli was also affected by light intensity, and the optimum light intensity was in the range of 7500 lx and 10000 lx, respectively.

; spore development; life cycle; temperature; light intensity

(本文編輯: 梁德海)

Jan. 5, 2016

[National Natural Science Foundation of China, No.30870161, No. 31270251, No.31570209]

Q949.29

A

1000-3096(2016)10-0025-08

10.11759/hykx20131030001

2016-01-05;

2016-05-07

國家自然科學基金項目(30870161, 31270251, 31570209)

賈瀟博(1991-), 男, 遼寧省撫順市人, 碩士研究生, 主要從事海藻生態學研究, E-mail: 609198843@qq.com; 王宏偉, 通信作者, 教授, 博士, 從事海藻分類、多樣性及其分子系統學研究, E-mail: kitamiwang@163.com