暗紋東方鲀生長性狀相關微衛星標記篩選

馬愛軍, 鄒 杰, 孫建華, 王 婷, 王廣寧, 崔文曉, 王新安, 劉大勇, 郭正龍

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暗紋東方鲀生長性狀相關微衛星標記篩選

馬愛軍1, 2, 鄒 杰1, 3, 孫建華1, 3, 王 婷1, 王廣寧1, 崔文曉1, 3, 王新安1, 2, 劉大勇4, 郭正龍4

(1. 中國水產科學研究院黃海水產研究所農業部海洋漁業可持續發展重點實驗室青島市海水魚類種子工程與生物技術重點實驗室, 山東青島266071; 2. 青島海洋科學與技術國家實驗室海洋生物學與生物技術功能實驗室, 山東青島 266071; 3. 上海海洋大學水產與生命學院, 上海201306; 4. 江蘇中洋集團股份有限公司, 江蘇南通226600)

為了篩選與暗紋東方鲀()生長相關的分子標記, 作者采用SSR結合BSA技術對同齡孵化群體的同池養殖暗紋東方鲀生長差異性狀標記進行篩選。利用85對微衛星引物對暗紋東方鲀生長快、慢各30尾個體構建的兩個基因池進行分析, 共篩選到14個差異位點。然后分析這14個差異微衛星位點在這60個暗紋東方鲀個體中的基因型差異, 結果表明: 位點TOP03、TOG01、fms15、fms75與生長性狀呈現極顯著負相關關系(<0.01), fms89與生長性狀呈現極顯著正相關關系(<0.01)。用另外30個個體(生長快慢各15個)進行驗證實驗后, 結果只有位點fms15、fms75與生長性狀顯著相關, 相關系數分別為–0.411和–0.384。這兩個微衛星位點對于暗紋東方鲀生長性狀有顯著效應, 為開展暗紋東方鲀的分子標記輔助育種提供了有價值的參考標記。

暗紋東方鲀(); 生長性狀; 微衛星; 相關性分析

暗紋東方鲀()屬硬骨魚綱(Osteichthyes)、鲀形目(Telraodontiformes)、鲀科(Tetradontidae)、東方鲀屬(), 其分布集中于北太平洋西部地區的東海及黃海海域, 且可進入長江到江陰一帶, 并可定居太湖[1]。暗紋東方鲀不僅能夠養血補氣, 而且向來以肉味鮮美聞名, 為傳統美食中的典范, 是具有很高經濟價值的特種水產養殖品種[2-3]。在實際養殖中, 暗紋東方鲀養殖技術日益成熟, 養殖規模不斷擴大, 養殖產量逐年增高, 到2014年預期產量已達到40 000t以上[2], 但都普遍存在同一暗紋東方鲀群體出現生長性狀差異明顯的情況, 往往一個養殖周期需要淘汰掉許多小的個體, 加之暗紋東方鲀具有相互殘食的特性[3], 小個體易受傷且死亡率極高, 而且還會受傷得病感染其他魚體[4]。因此, 進行暗紋東方鲀大小差異的微衛星標記研究既為暗紋東方鲀的良種選育提供依據, 也對提高養殖產量和經濟效益具有深遠的意義。

微衛星(Microsatellite)目前不僅廣泛應用于遺傳多樣性分析重要性狀標記的篩選[5]、遺傳圖譜的構建[6]和發育研究[7]等, 而且可用于遺傳性疾病的連鎖分析和基因診斷、品種鑒定、農作物及動物育種等領域[8]。微衛星在水產動物生長性狀分子標記方面的運用上也取到了一定的成果, Cnaani等[9]在利用微衛星標記對橙色莫桑比克羅非魚()和奧利亞羅非魚()的雜交F2代進行與生長性狀的相關性分析, 篩選得到位點UNH130和體長相關。佟廣香等[10]研究哲羅魚 ()生長速度相關性狀的微衛星篩選得到標記106INRA、166TUF與測量的7個生長性狀顯著相關; 111TUF和210TUF與6個生長性狀顯著相關。劉偉等[11]研究3種鯉魚()群體的生長性狀與微衛星標記的關系時發現: 黃河鯉()的生長性狀和位點Mfw5相關; 建鯉()的生長性狀與位點Cca09、Hlj013、Mfw2、MfW7和 Mfw29相關; 黑龍江野鯉()的生長性狀與位點Mfw4、Mfw6和Mfwl1相關。王桂興等[12]研究利用30對牙鲆()微衛星標記對雌核發育個體進行分析, 得到有8個座位分別與體質量、體長、體高性狀的相關性顯著。目前有關利用微衛星標記對暗紋東方鲀生長差異性狀分析研究較少, 為提高暗紋東方鲀的育種效率本研究擬運用85對微衛星標記, 采用SSR結合BSA技術比較分析暗紋東方鲀群體的生長差異性狀, 篩選出可能與暗紋東方鲀生長性狀相連鎖的微衛星標記, 為進行暗紋東方鲀的苗種選育提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究所用暗紋東方鲀樣本由江蘇中洋河豚莊園公司提供, 取自2010年的同池同時孵化的混合群體, 約180日齡的個體。分別選取生長性狀處于兩極端的差異個體各30尾, 其中, 生長快的F(fast)組個體全長都大于13 cm(14.8 cm±1.8 cm); 生長慢的S(slow)組個體全長都小于6 cm(4.9 cm±1.1 cm)。每個樣本形態學測量完后, 剪取部分尾鰭鰭條分裝于離心管中并置于–80℃冰箱中保存以備后用。

1.2 實驗引物

使用引物序列參照Ma等[13]和自己設計暗紋東方鲀引物共16對, 古川聰史[14]、郝君[15]和Kai等[16]紅鰭東方鲀()微衛星引物69對, 由上海生工生物科技有限公司合成, 實驗所用部分微衛星引物信息見表1。

1.3 實驗方法

1.3.1 基因組DNA的提取及檢測

取保存兩組樣本F組和S組的尾鰭各30 mg, 按照基因組DNA提取試劑盒提取DNA。并用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定, 核酸蛋白測定儀檢測DNA濃度, 無菌水稀釋到濃度為50 ng/μL, –20℃冷凍保存。

表1 本實驗所用部分微衛星引物的核心序列、引物序列、退火溫度和片段長度

續表

基因座引物序列(5′-3′)片段長度(bp)退火溫度(℃) f1637CCTGAAGCACACACTGCAAG200~20860 CCTGATGACACCTGCTCTGA f1690TCCTCCAACTTCACGCTCTT220~23559 AGGTACTTCTGGACCGCATC f1691GTTTTGCAGCACGAGTGTGT175~19559 GCATCCAGGCAAGGATTAAA f1781TTTTCTTTCACACCCCGAAC181~20257 CCCCACTTCCCCTCTTTTAG TOG01AACACCTCCACCTGCTTGCT280~29054 ATTGCCCAGTTGACTTTCC TOG02CACAAGGTGAGGACAAAGAC155~16554 TTGGCAACAGTTAGGTAGGT TOG03TCGGTGATGATCGGTGAC280~29057 TAAGCTCTGAGCCAAAAGG TOP01AAAAGAATGCTTATCCTG200~22552 TTACTTGTGACCTGCGT TOP02TCTTCTTGCTATTTTGCT260~30054 ATGAGTCTGGTCCTGCT TOP03TCCGCTATCACATCTATCT155~17553 CATGATGCTCCTGGAAAAT fms15CTGGCATAACTGATTAGGCTGT165~17560 ATAGCTGACAGCACGGGAAC fms43GTGCCCACAAAGATGGAAAT12060 TCCTTGGCAGAGTCAGTCCT TOb10ACCCACTCCGTCCTTCCT310~38061 TCAACCGCCCTTCCAACT f169CTCCCACGCAAGCAGTCA280~30060 CTCAGTATCAGGGGTCAAAGAAAT f362TTACACTGGCCAAACAACTCTG398~40560 GGCCTATAGGACCTCTGGACT f1372GAGGACATCCGATCACATCC212~24060 CCCTGCAGGAGGAATACCAG f1497CACCTGCCCGAAAGTTTAAG170~18258 TGAAAGCCCAAGAGAGGAAA

1.3.2 BSA基因池的建立及其PCR擴增

F和S兩組暗紋東方鲀各30個樣本, 從F組每個樣本抽取10 μL DNA溶液混合成F組基因池, 同樣方法獲得S組基因池。用85對微衛星引物對F和S兩組基因池進行PCR擴增, 體系為: buffer 1.4 μL、dNTP 1.2 μL (mmoL/μL)、上下游引物各0.6 μL(10 μmol)、模板1 μL (50 ng/μL)、taq酶 0.2 μL(5 U/μL)、補充去離子水10 μL。PCR程序是: 預變性(95℃5 min), 循環30次(變性94℃30 s、退火30 s、復性72℃30 s), 延伸(72℃10 min), 結束(4℃)。將85對微衛星引物的PCR擴增產物變性, 在8%的變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離, 使用硝酸銀法染色[17], 記錄帶型并用掃描保存電泳結果。

1.3.3 篩選差異條帶及個體PCR擴增

比較分析兩個基因池聚丙烯酰胺電泳條帶, 初步找出F和S兩組具有差異性條帶的微衛星位點作為候選的生長差異的微衛星分子標記, 將篩選出的具有差異的引物按照上述的PCR條件, 對構建基因池的60個暗紋東方鲀個體進行PCR擴增、聚丙烯酰胺凝膠電泳及硝酸銀法染色, 再次記錄差異條帶。

1.3.4 生長性狀差異條帶分析

使用SPSS軟件對篩選出的差異等位基因片段與暗紋東方鲀生長性狀這兩個變量的進行相關性檢驗, 判斷差異等位基因片段和暗紋東方鲀生長性狀的相關性情況, 篩選出與暗紋東方鲀生長差異性狀顯著相關的位點。

1.3.5 驗證生長性狀差異位點

從江蘇中洋河豚莊園公司再次采樣, 來自不同家系混養的同日齡的暗紋東方鲀, 生長顯著快、慢各15尾, 將篩選的微衛星位點, 對上述新樣本個體進行PCR擴增、聚丙烯酰胺凝膠電泳及硝酸銀法染色, 統計特異性條帶并進行相關性檢測, 以驗證篩選到標記的準確性。

1.3.6 差異等位基因片段切膠測序

將驗證實驗的差異條帶進行切膠回收、純化, 送至上海生工生物科技有限公司進行克隆、測序, 以驗證差異片段的是否為相應序列。

2 結果

2.1 BSA基因池的差異條帶篩選

使用試劑盒提取基因組DNA, 紫外線分光光度計進行測定及瓊脂糖檢測后, 選取質量好的DNA用于下一步實驗。用提取的高質量DNA構建了F和S兩組基因池。85對引物對構建的F和S兩組基因池進行PCR擴增, 將擴增產物變性后進行8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染, 結果顯示有78對引物具有清晰目的條帶, 篩選出TOP01、TOP03、TOG01、TOG02、Tob10、Tob13、fms15、fms75、fms89、f169、f362、f383、f1372和f1497共14對引物的電泳條帶在F組和S組間具有差異等位基因, 如圖1為F和S基因池的差異等位基因的聚丙烯酰胺電泳圖。

2.2 統計個體中帶型的差異等位基因片段

將F和S兩組基因池篩選的14對具有差異等位基因片段的微衛星引物, 對構建基因池的60個個體進行PCR擴增, 通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分析結果。結果顯示微衛星位點f383擴增產物的PAGE條帶模糊無法辨認, 位點Tob13的產物則無多態性、無差異, 所以兩個微衛星位點被舍棄。其余位點差異帶型統計結果見表2。圖2為引物fms15、fms75在兩組個體中的PCR擴增帶譜, 可以看出兩微衛星位點在F組和S組的目的等位基因片段有著較明顯的差異, fms15位點180 bp和fms75位點130 bp的差異等位基因片段在F組的擴增帶譜中出現的頻率較低, 在S組的擴增帶譜出現的頻率較高(箭頭指示的為差異等位基因片段)。

F. 生長快組; S. 生長慢組

F. fast; S. slow

2.3 差異等位基因片段的SPSS相關性分析

根據表2結果, 通過SPSS13.0軟件對篩選的12個微衛星位點的差異等位基因片段與暗紋東方鲀的生長差異性狀進行相關性分析, 已知在0.00~0.33呈現弱相關性, 0.33~0.67呈現中相關性, 0.67~1.00呈現強相關性。由表3可得, 位點TOP01、TOG02、Tob10、f169、f362、f1372的生長差異相關性不顯著(>0.05); 位點TOP03、TOG01、fms15、fms75、fms89生長差異相關性極顯著(<0.01), 且為中度相關(0.33<<0.67), 其中有1個微衛星位點fms89 310 bp的等位基因片段與暗紋東方鲀的F組性狀存在一定的正相關性, 其余4個微衛星位點則為負相關性。

表2 F和S兩組12個位點的差異等位基因片段統計表

M. DL500bp分子標記; F. 生長快組; S. 生長慢組

M. DL500bp DNA marker ; F. fast; S. slow

2.4 驗證生長顯著差異的微衛星位點

經相關性分析得到TOP03、TOG01、fms15、fms75和fms89 5個微衛星位點與生長差異性狀存在極顯著相關關系, 且為中等相關; 位點f1497與生長性狀存在顯著相關, 但相關強度較弱。然后, 將重新選取的不同群體的暗紋東方鲀生長差異顯著的快和慢各15個個體進行5個微衛星引物的PCR擴增、聚丙烯酰胺凝膠電泳及硝酸銀染色, 統計差異片段, 并進行相關性分析(表4)。由表4可得, 位點fms15擴增的差異等位基因片段在生長差異的F和S組重新出現的頻率分別為0和33.33%; 位點fms75擴增的差異等位基因片段在生長差異的F和S組重新出現的頻率分別為6.67%和40.00%, 且分析相關性關系均呈現顯著性, 而其余3個則相關性不顯著。得到的微衛星位點fms15和fms75的結果基本與實驗預期一致, 相關系數分別為–0.411和–0.384, 進一步驗證了作者所篩選的與暗紋東方鲀生長性狀存在顯著相關性的微衛星位點的準確性。圖3為fms15、fms75兩個位點的PCR擴增帶譜(箭頭指示的為差異等位基因片段)。

表3 微衛星位點與暗紋東方鲀生長差異性狀的相關性分析

注: *. 顯著相關(<0.05); **. 極顯著相關(<0.01)

2.5 差異等位基因片段切膠測序及BLAST比對

對具有差異條帶的微衛星引物進行驗證的實驗, 得到fms15和fms75存在顯著性的差異。然后將其差異條帶進行切膠回收, 送至上海生工生物科技有限公司進行序列克隆、測定, 獲得微衛星位點fms15差異條帶的DNA序列。位點fms15的測序結果為: TCTGGCATAACTGATTAGGCTGTAGCATGAATGTAGCATGTAGCAAGAATGCCAGCATCCTCTTACGGTGTGGAACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAGAGAGGGCTATCCATTAGCGAAAGCAATCTGCAGTTCCCGTGCTG TCAGCTATA, 通過NCBI數據庫BLAST比對, 證實該片段序列和紅鰭東方鲀發布的基因組一段高度吻合, 同源性達到98%, 差別在于序列中有3個堿基發生置換(G-C、C-G、G-A); 同時發現該序列預測功能可能與RNA結合蛋白和CXADR膜蛋白有關。而位點fms75因為基因片段較小、非特異性擴增條帶較多、回收DNA濃度較低, 導致未能獲得理想擴增結果。

M. DL500bp分子標記; F. 生長快組; S. 生長慢組

M. DL500bp DNA marker; F. fast; S. slow

表4 差異等位基因片段在個體擴增帶型中的出現次數統計

3 討論

3.1 微衛星分析方法

分群分離分析法(BSA)的基本原理是從某一分離群體中篩選出一定數量具有目標基因表型差異的個體, 分別構成2個亞群或集團; 該方法可用來快速鑒別與特定基因或染色體區域連鎖的標記[18]。現在已經廣泛應用于動植物抗性基因、生長相關性狀的篩選鑒定工作當中[19-20]。王美玉等[21]采用69個微衛星位點對半滑舌鰨()極大群體和極小群體的基因型分布進行篩選, 得到12個微衛星位點存在差異, 在其后的驗證群體與生長性狀相關的檢驗中也呈現出顯著差異, 說明采用極端群體進行初篩有效。張天時等[22]采用分離群體標記法也篩選出與中國對蝦() 生長性狀相關的微衛星位點。本實驗則也采用BSA法將收集的暗紋東方鲀分為F和S組, 進行差異微衛星位點的初篩選。然后將這些標記對群體內個體進行相關分析, 并驗證篩選極端群體標記的有效性。

微衛星遺傳標記為共顯性標記, 且檢測方便, 數量性狀基因位點定位常采用微衛星遺傳標記分析, 是目前水產動物數量性狀基因位點定位的常用方法之一。近幾年, 國內研究者利用微衛星標記也得到了鯽()[23]、青蝦()[24]、刺參()[25]和中華絨螯蟹()[26]等生長性狀相關聯的微衛星位點。因魚類大多數的經濟性狀屬于數量性狀, 遺傳基礎復雜且受多基因調控, 易受環境影響, 表現為連續變異, 從而不能明確表現型與基因型之間的對應關系[27]。但在基因組時代分析大批DNA分子標記與性狀連鎖關系、分子標記與數量性狀的相關關系, 得到與一個或多個標記的遺傳相關的數量性狀, 通過改變相應基因型頻率, 達到改變表型的目的[28]。本研究采用微衛星分子標記的方法對暗紋東方鲀生長差異性狀進行研究, 從分子層面揭示數量性狀的遺傳基礎, 后續的工作將對篩選獲得的微衛星標記進行其他群體驗證和多代驗證, 進一步證實其適應范圍、準確性和有效性, 以達到能合理地應用該標記指導育種, 提高育種速度, 改良重要生長性狀。

3.2 與生長性狀顯著相關的微衛星標記

Reed等[29]通過對小鼠進行基因敲除試驗后, 發現小鼠()的體質量性狀是受多個基因控制的性狀。劉偉等[11]對3種不同地理群體的鯉研究發現鯉的生長性狀也與多個基因相關, 本研究也得到了類似的結果: 利用85對東方鲀微衛星引物對60個生長性狀差異顯著的個體進行SSR結合BSA技術的分析, 得到了14個微衛星位點能在暗紋東方鲀F和S兩組基因池中擴增出差異條帶, 并通過單個樣本的SSR分析驗證得到了其中5個微衛星位點擴增的差異條帶顯著, SPSS分析得到該5個微衛星位點與生長差異性狀相關極顯著, 說明這些微衛星位點可能與暗紋東方鲀的生長差異性狀有一定的關聯, 如果條帶所對應基因位點與生長差異性狀無關, 則在大小群體之間出現的頻率應該基本一致。再用新的生長性狀差異明顯的群體進行驗證實驗, 結果只有fms15和fms75兩個位點與生長差異形狀存在顯著相關, 進一步說明這兩個位點與暗紋東方鲀的生長性狀存在著一定的關聯。為進一步確認本試驗中微衛星位點是否與暗紋東方鲀的生長性狀有關, 我們將fms15位點測序所得全序列與NCBI的BLAST數據庫進行比對, 去尋找與生長相關的基因及蛋白, 作為輔助數據驗證本試驗結果的可靠性。對比完后發現, 該序列可能與RNA結合蛋白和CXADR膜蛋白有關, 但目前并沒有具體的研究結果。

本研究所用BSA法只能對目標基因進行分子標記, 而目標基因與分子標記間連鎖的緊密程度不能確定, 也無法得知在遺傳連鎖圖上的位置, 更不能完成后續的QTL定位, 因此目前還不能完全確定fms15或fms75兩個位點是否存在多位點關聯效應, 該遺傳標記是否可以作為暗紋東方鲀優勢生長性狀分子輔助育種標記還需要進一步深入驗證和研究。

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Screening growth-related microsatellite markers in

MA Ai-jun1, 2, ZOU Jie1, 3, SUN Jian-hua1, 3, WANG Ting1, WANG Guang-ning1, CUI Wen-xiao1, 3, WANG Xin-an1, 2, LIU Da-yong4, GUO Zheng-long4

(1. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences; Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture; Qingdao Key Laboratory for Marine Fish Breeding and Biotechnology, Qingdao 266071, China; 2. Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266071, China; 3. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 4.Jiangsu Zhongyang Group Limited by Share Ltd, Nantong 226600, China)

A population ofwith significant growth differences was investigated for screening molecular markers linked to growth traits, using SSR combined with bulked segregation analysis (BSA). Two gene pools were respectively constructed using 30 DNA templates isolated fromsamples with significantly different growth rates and then amplified by 85 pairs of microsatellite primers. The unique alleles were found in 14 loci. These 60individuals were genotyped by SSRs. The results showed that loci TOP03, TOG01, fms15, and fms75 had a highly significant negative correlation with growth trait (< 0.01), while fms89 showed extremely significant positive correlation with growth trait (< 0.01). The verification test using another population of 30 randomly selectedwith significantly different growth rates indicated that only loci fms15 and fms75 were significantly correlated with growth trait, with correlation coefficients of –0.384 and –0.411, respectively. Therefore, these two microsatellite loci with a significant linkage with growth traits could be used as reference markers for marker-assisted breeding of.

; growth trait; microsatellite; correlation analysis

(本文編輯: 譚雪靜)

Sept. 17, 2015

[Jiangsu Science and Technology Support Program, No. BE2013345; Jiangsu Aquatic Three New Projects , No. Y2013-12]

S917.4

A

1000-3096(2016)10-0016-09

10.11759//hykx 20150917002

2015-09-17;

2015-12-03

江蘇省科技支撐計劃資助項目(BE2013345); 江蘇省水產三新工程資助項目(Y2013-12)

馬愛軍(1971-), 女, 山東榮成人, 博士, 研究員, 博士生導師, 主要從事魚類繁育養殖生物學與遺傳育種研究, E-mail: maaj@ ysfri.ac.cn