UGT1A6 A541G基因多態性對癲癇兒童丙戊酸鈉血藥谷濃度的影響

姜永生，楊 琳

(西安交通大學第二附屬醫院兒科，陜西 西安 710004)

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UGT1A6 A541G基因多態性對癲癇兒童丙戊酸鈉血藥谷濃度的影響

姜永生，楊 琳

(西安交通大學第二附屬醫院兒科，陜西 西安 710004)

目的 探討尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉移酶(UGT)1A6 A541G基因多態性對丙戊酸鈉血藥谷濃度的影響。方法 患兒服藥至少5個半衰期后，丙戊酸鈉血藥谷濃度達到穩態時采集靜脈血，全血基因組DNA提取后經PCR擴增目標基因，使用焦磷酸測序技術檢測UGT1A6 A541G基因多態性，同時氣相色譜法測定丙戊酸鈉血藥谷濃度。結果 在67例患兒中，UGT1A6 A541G基因型為A/A者49例(73.1%)，A/G者17例(25.4%)，G/G者1例(1.5%)，根據基因型分為A組(A/A者)和B組(A/G者和G/G者)。B組患兒丙戊酸鈉的標準血藥谷濃度均值(3.43±0.38)mg/mL較A組(4.13±0.21)mg/mL低，結果有顯著統計學差異(t=2.51，P<0.05)。結論 UGT1A6 A541G基因多態性影響丙戊酸鈉的代謝與排泄，提示含有UGT1A6 A541G等位基因的患兒口服丙戊酸鈉應高于常規用量。

UGT1A6 A541G基因多態性；丙戊酸鈉；癲癇；兒童

丙戊酸鈉是目前臨床上最常用的一線抗癲癇藥物之一，臨床發現丙戊酸鈉的用藥劑量和血藥谷濃度存在很大的個體差異，部分患兒即使應用較小劑量，其血藥谷濃度仍會超過有效血藥谷濃度范圍。臨床上需要對其進行血藥谷濃度監測，并根據監測結果和療效來調整藥物的使用劑量，從而提髙其療效同時降低不良反應的發生。藥物的代謝主要受藥物代謝酶影響，尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉移酶 (uridine diphosphoglucuronyl transferase，UGT)是丙戊酸相代謝酶。UGT A541G基因具有多態性而導致酶的活性改變，UGT1A6 A541G基因多態性可能通過影響酶的活性而影響丙戊酸鈉的血藥谷濃度[1]。本研究旨在調查UGT1A6 A541G基因多態性在癲癇患兒中的分布，探討基因多態性與丙戊酸鈉血藥谷濃度個體差異的關系。

1資料和方法

1.1研究對象

收集西安交通大學第二附屬醫院兒科2015年11月至2016年4月住院癲癇患兒相關臨床資料。納入標準：服用丙戊酸鈉口服液且已完善UGT A541G基因多態性分析、丙戊酸鈉血藥谷濃度檢測。排除標準：口服兩種及以上抗癲癇藥物；聯合生酮飲食治療；聯合激素治療；檢測血藥濃度期間合并肝、腎功能檢測異常；合并其他遺傳代謝疾病。

共收集67例活動性癲癇患兒資料，其中男性患兒38人，女性患兒29人，最小年齡2歲，最大年齡13歲；服用丙戊酸鈉的劑量為10～30mg·kg-1·d-1，分3次服用，服用丙戊酸鈉的總療程為5天至3年。

1.2標本采集

服藥至少5個半衰期后，丙戊酸鈉血藥谷濃度達到穩態時采集靜脈血，早晨空腹服藥前采靜脈血4mL，其中2mL置普通試管以測定丙戊酸鈉血藥谷濃度,另外2mL置無菌無酶的EDTA抗凝試管中4℃保存。

1.3尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉移酶1A6 A541G基因多態性檢測

1.3.1人血標本DNA提取

采用全血基因組DNA提取試劑盒提取DNA，提取結束后加入預熱65℃洗出液150μL溶解DNA，放置過夜，待用。

1.3.2聚合酶鏈反應

設計并合成UGT1A6 A541G擴增和測序的引物，按如下條件進行PCR擴增：PCR體系50μL。10×PCR反應緩沖液5μL，三磷酸脫氧核糖核酸(dNTP)4μL(各10mmol/L)，蒸餾水37.5μL，正向引物和負向引物各0.5μL(100μmol/L)，rTaq DNA多聚酶0.5μL(5IU/μL)，基因組DNA2.0μL(20～30μg/L)。PCR條件為94℃預變性10min，變性、退火和延伸分別為94℃30s、55℃30s和72℃45s，共50個循環，最后72℃延伸 7min，最后在4℃保溫。取擴增產物5μL和上樣緩沖液1μL混勻，在2%瓊脂糖電泳，可獲得清晰的擴增產物[2]。

1.3.3焦磷酸測序

①測序引物退火緩沖液的配制：將10μmol/L測序引物工作液1μL加入24μL退火緩沖液中，得到0.4μmol/L測序引物退火緩沖液。測序板上每個孔加入測序引物退火緩沖液25μL；②配置單鏈DNA分離液：2μL磁珠和40μL結合緩沖液，加高純水18μL配置成60μL單鏈DNA分離液；③PCR產物固定：每個PCR樣本20μL加入60μL單鏈DNA分離液，在常溫下劇烈振蕩10min，使得親和素包被的磁珠與生物素標記的單鏈充分結合；④單鏈DNA模板的制備：在真空工作站中，1號位加入70%乙醇50mL，2號位加入變性緩沖液40mL，3號位加入洗液50mL，4號位加入高純水50mL，5號位加入高純水70mL，打開真空泵，將真空工具在6號位清洗15s，移動到PCR板吸附磁珠15s，依次在1、2、3號位清洗5s、5s、10s；⑤引物雜交：將真空工具真空閥關閉，放入含有測序引物的板中，充分搖動釋放磁珠，在80℃雜交2min，室溫靜置5min冷卻；⑥測序：使用焦磷酸測序儀和測序通用試劑盒，按儀器和試劑說明書進行PCR產物的SNP位點的焦磷酸測序[2]。

1.4丙戊酸鈉血藥谷濃度測定及其標準化

氣相色譜法測定丙戊酸鈉血藥谷濃度(μg/mL)。為消除體重及服藥劑量對血藥谷濃度的影響，將氣相色譜法所測得血藥谷濃度除以患兒每日每千克體質量的服藥量(mg/kg)，即標準化的血藥谷濃度[3]。

1.5統計學方法

采用SPSS 13.0統計學軟件處理分析數據。統計分析數據用均值±標準差表示，UGT1A6 541位點的基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡及基因多態性分布的差異用χ2檢驗[4]，UGT1A6 541位點A/A、A/G、G/G基因型間血藥谷濃度差異的分析用t檢驗，檢驗水準取α=0.05。定義P<0.05為差異具有統計學意義。

2結果

2.1研究對象的基因型分析

67例癲癇患兒A、G的等位基因頻率分別為85.8%和14.2%，其基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=1.84，P>0.05)。67例患兒UGT1A6 541位點基因型為A/A者49例(73.1%)，A/G者17例(25.4%)，G/G者1例(1.5%)。

2.2基因多態性與丙戊酸鈉標準血藥谷濃度的關系

UGT1A6 541位點A/A基因型與含有UGT1A6 541位點G等位基因的患兒丙戊酸標準血藥谷濃度的比較：根據上述基因分型將UGT1A6 541野生型(即A/A基因型)的患兒作為A組，含UGT1A6 541突變型的患兒(包括A/G者和G/G者)作為B組。B組患兒丙戊酸鈉的標準血藥谷濃度均值(3.43±0.38)mg/mL較A組(4.13±0.21)mg/mL低，見表1。

分組例數(n) 性別 男(n)女(n)標準血藥谷濃度平均值(mg/mL)A組4927224．13±0．21B組181173．43±0．38

3討論

雖然血藥谷濃度監測對臨床個體化給藥起著一定的作用，但不能在用藥前預測機體對藥物的反應，常需頻繁監測血藥谷濃度間接了解患兒的藥物代謝水平，造成初始加量時間偏長，長期維持劑量可能波動較大，藥物基因組學為個體化給藥的嘗試提供了一個新的方法。分析患者的藥物基因組學，結合病人的病理生理特征、臨床表型，制定合理、安全、有效的用藥方案，真正做到個體化給藥，達到藥物有效性及安全性目的，是未來精準醫療的一個方向。

3.1尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉移酶1A6 A541G基因多態性檢測有助于指導癲癇兒童丙戊酸鈉使用

丙戊酸經胃腸道吸收，隨血流透過血腦屏障作用于神經元相應的靶點，大部分由肝臟代謝，包括與UGT結合，主要由腎臟排出體外，整個過程涉及受體及各種酶的基因變異，從而影響藥物的吸收、分布和代謝，最終影響藥物的臨床療效[5]。葡萄糖醛酸基轉移酶作為肝臟重要的代謝酶，其基因多態性研究近來備受關注，本研究中癲癇患兒中UGT1A6 A541G多態性的分布結果，A541G位點突變發生率為26.9%，與亞裔人群的突變頻率基本一致，與非裔美國人群的突變頻率也基本一致[6-7]。目前研究認為尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉移酶(UGT)基因的雜合子突變型及突變型可加快藥物的代謝與排泄，從而造成攜帶UGT1A6突變基因型的患者體內標準血藥谷濃度較野生基因型低[7-8]，對指導臨床合理、安全、個體化調整藥物有一定作用。本研究結論與相關文獻報道相一致，支持含有UGT1A6 A541G等位基因的患兒加快了藥物的代謝與排泄，從而在臨床使用丙戊酸鈉時應較常規加大用量。

3.2現階段臨床應用尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉移酶1A6 A541G基因多態性檢測的局限性

丙戊酸的代謝過程相當復雜，除UGT1A6參與丙戊酸的代謝過程外，UGT1A9、UGT2B7等其他 Ⅱ相代謝酶也有協同效應，丙戊酸代謝也受到諸如CYP2A6、CYP2B6Ⅰ相代謝酶及脂肪酸結合蛋白的影響[4,9]。諸如年齡、種族、營養狀況(血漿蛋白水平)以及胃、腸、肝、腎功能等因素對藥物吸收、分布、代謝、排泄的影響較大，進而影響丙戊酸鈉血藥濃度。含有UGT1A6 A541G等位基因的患兒使用丙戊酸鈉時較常規增大用量的具體數值尚需摸索。因此目前基因多態性檢測結果指導抗癲癇治療方案調整尚待進一步深入研究。

綜上所述，本實驗中攜帶UGT1A6突變基因型的患兒體內標準血藥谷濃度較野生基因型低，支持含有UGT1A6 A541G等位基因的癲癇患兒丙戊酸鈉代謝與排泄速率加快，提示含有UGT1A6 A541G等位基因的患兒口服丙戊酸鈉應高于常規用量。

[1]Chatzistefanidis D, Lazaros L, Giaka K,etal. UGT1A6- and UGT2B7-related valproic acid pharmacogenomics according to age groups and total drug concentration levels[J]. Pharmacogenomics,2016,17(8):827-835.

[2]劉娜,張抗懷,蘇燕勝,等.基因分型指導非瓣膜性房顫患者華法林抗凝治療的研究[J].中國醫院藥學雜志,2016,36(8):654-658.

[3]Chatzistefanidis D, Georgiou I, Kyritsis A P,etal. Functional impact and prevalence of polymorphisms involved in the hepatic glucuronidation of valproic acid [J]. Pharmacogenomics,2012,13(9):1055-1071.

[4]Wang Y, Gao L, Liu Y P,etal. Effect of UGT1A6 A541G genetic polymorphism on the metabolism of valproic acid in Han epileptic children from Henan[J]. Chinese Journal of Contemporary Pediatrics,2010,12(6):429-432.

[5]Munisamy M, Tripathi M, Behari M,etal. The effect of uridine diphosphate glucuronosyltransferase (UGT)1A6 genetic polymorphism on valproic acid pharmacokinetics in Indian patients with epilepsy: a pharmacogenetic approach [J]. Mol Diagn Ther,2013,17(5):319-326.

[6]Jalil N J, Bannur Z, Derahman A,etal. The Implication of the Polymorphisms of COX-1, UGT1A6, and CYP2C9 among Cardiovascular Disease (CVD) Patients Treated with Aspirin[J]. ournal of Pharmacy & Pharmaceutical Sciences,2015,18(3):474-483.

[7]Jain P, Shastri S, Gulati S,etal. Prevalence of UGT1A6 polymorphisms in children with epilepsy on valproate monotherapy[J]. Neurology India,2015,63(1):35-39.

[8]Guo Y, Hu C, He X,etal. Effects of UGT1A6, UGT2B7, and CYP2C9 Genotypes on Plasma Concentrations of Valproic Acid in Chinese Children with Epilepsy[J].Drug Metabolism and Pharmacokinetics,2012,27(5):536-542.

[9]Wang Q, Zhao L, Liang M,etal. Effects of UGT2B7 Genetic Polymorphisms on Serum Concentrations of Valproic Acid in Chinese Children With Epilepsy Comedicated With Lamotrigine[J]. Ther Drug Monit,2016,38(3):343-349.

[專業責任編輯：周戩平]

Effect of UGT1A6 A541G genetic polymorphism on serum concentration of sodium valproate in children with epilepsy

JIANG Yong-sheng, YANG Lin

(Department of Pediatrics, Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Shaanxi Xi’an 710004, China)

Objective To evaluate the effect of uridine diphosphoglucuronyl transferase (UGT) 1A6 A541G genetic polymorphism on serum concentration of sodium valproate. Methods Venous blood of epileptic children with serum concentration of sodium valproate reaching steady state after at least 5 half-lives was collected. Target gene was amplified by PCR after whole blood genomic DNA extraction, and UGT1A6 A541G gene polymorphism was detected by pyrosequencing. Method of gas chromatography was used to assay serum concentration of sodium valproate. Results The genotypic frequencies of UGT1A6 A541G were as follows: A/A in 49 cases (73.1%), A/G in 17 cases (25.4%) and G/G in 1 case (1.5%). According to the genotypes of UGT1A6 A541G the patients were divided into two groups, group A (A/A) and group B (A/G and G/G). Mean value of serum concentration of sodium valproate of patients in group A (4.13±0.21mg/mL) was higher than that in group B (3.43±0.38mg/mL) with statistical significance (t=2.51,P<0.05).Conclusion The genetic polymorphism of UGT1A6 A541G affects metabolism and excretion of sodium valproate, which indicates that the dosage of sodium valproate for patients with UGT1A6 A541G allele should be higher than usual.

UGT1A6 A541G genetic polymorphism; sodium valproate; epilepsy; children

2016-6-20

姜永生(1984-)，男，住院醫師，碩士，主要從事兒童癲癇臨床診療。

楊 琳，主任醫師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.12.032

R725

A

1673-5293(2016)12-1526-03