粉防己堿對絨癌BeWo細胞增殖和凋亡的作用

方 靜，薛 艷，安瑞芳

(西安交通大學第一附屬醫院婦產科，陜西 西安 710061)

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粉防己堿對絨癌BeWo細胞增殖和凋亡的作用

方 靜，薛 艷，安瑞芳

(西安交通大學第一附屬醫院婦產科，陜西 西安 710061)

目的 探討粉防己堿對人絨癌BeWo細胞株增殖和凋亡的作用。方法 采用不同濃度的粉防己堿處理人絨癌BeWo細胞株，在不同的作用時間采用MTT和流式細胞儀檢測細胞增殖及凋亡的變化；Western blot檢測PCNA和Survivin的表達。結果 采用不同劑量的粉防己堿處理BeWo細胞不同的時間，細胞均表現出生長的抑制，且為劑量及時間依賴性(P<0.01)。0、5、10、20 μg/mL粉防己堿作用24小時后，細胞凋亡的比例依次為3.52%±0.62%、8.32%±2.1%、13.45%±2.7%和27.38%±3.1 %(F=41.616，P<0.01)，PCNA蛋白表達分別為0.85±0.05、0.53±0.04、0.22±0.01和0.03±0.01(F=244.375，P<0.01)，Survivin蛋白表達分別為1.06±0.01、0.98±0.06、0.52±0.03和0.39±0.03(F=529.4，P<0.01)。結論 粉防己堿可以對絨癌細胞株BeWo產生時間及濃度依賴的生長抑制作用，誘導絨癌細胞株的凋亡，有可能成為GTT化療方案的輔助治療藥物。

粉防己堿；絨癌；增殖；凋亡

妊娠滋養細胞疾病(gestational trophoblastic disease，GTD)是一種特殊的妊娠相關腫瘤，來源于胎盤絨毛滋養細胞，包括葡萄胎(hydatidiform mole，HM)、侵蝕性葡萄胎(invasive mole，IM)、絨毛膜癌(choriocarcinoma，CC)和胎盤部位滋養細胞腫瘤(placental site trophoblastic tumor，PSTT)等。后三者也被稱為妊娠滋養細胞腫瘤(gestational trophoblastic tmour，GTT)，其中CC是惡性程度最高的腫瘤，侵襲力強，早期發生血行轉移，自然死亡率高達90%以上，該疾病嚴重威脅育齡期婦女的健康狀況[1]。妊娠滋養細胞腫瘤源自于滋養細胞的異常增生，是對化療敏感的實體瘤，侵蝕性葡萄胎和絨癌可以通過化療治愈。但是，藥物抵抗性妊娠滋養細胞腫瘤已成為婦科腫瘤專家面臨的挑戰。因此，創新的實驗治療方案有待于研究以突破目前治療的難題。

粉防己堿是從中草藥粉防己的塊莖中提取的雙芐基異喹啉類生物堿，近年來的研究顯示粉防己堿可以抑制多種腫瘤細胞的增殖，并且誘導凋亡，這些腫瘤包括肝癌、膀胱癌、胃癌，肺癌，和白血病[2-5]。粉防己堿介導了參與細胞死亡及凋亡蛋白的表達和活化，包括p53、p21、Bax,、PAPR等。粉防己堿同樣也被發現可以成為聯合化療，促進化療效果的藥物[6]。但是關于粉防己堿用于GTT的治療效果目前未見報道。

本研究中采用不同濃度的粉防己堿處理人絨癌BeWo細胞株，在不同的時間檢測細胞增殖及凋亡的變化，同時檢測增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)和Survivin的表達，旨在探討粉防己堿對人絨癌BeWo細胞株增殖和凋亡的作用。

1材料與方法

1.1細胞株和試劑

人絨癌BeWo細胞株購自美國模式培養物集存庫(American type culture collection，ATCC) 細胞庫。Ham/F12培養基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自杭州四季青公司。粉防己堿購自美國Sigma公司，溶于二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)中，每次使用前用培養基稀釋至實驗所需濃度。抗體PCNA及Survivin購自于Santa Cruz生物公司。

1.2細胞培養

人絨癌BeWo細胞株用含15%胎牛血清的Ham/F12培養基，在37℃、5%CO2的培養箱內培養，以1.25g/L 胰酶和0.2g/L 乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)的混合液消化傳代。

1.3 噻唑藍檢測

將1×105個/孔的細胞接種于96孔培養板，24小時后更換含有不同濃度的粉防己堿(5、10、20μg/mL)的培養基。24小時后每天呈色一塊96孔培養板，共進行3天。加入噻唑藍(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)MTT(5mg/mL)20μL，培養4小時后，移去上清，每孔加入DMSO150μL，震蕩10分鐘后，上酶聯免疫檢測儀，測定490nm處各孔光吸光度，然后用公式計算出細胞增殖抑制率(inhibition rate，IR)：IR=(陰性對照A490值-實驗組A490值)/陰性對照A490值×100%。

1.4細胞凋亡的檢測

取BeWo細胞株常規消化，制成細胞懸液，然后以每孔1×107個細胞將處于對數生長期的BeWo細胞接種于6孔培養板，24小時后更換含有不同濃度的粉防己堿(5、10、20μg/mL)培養基，培養24小時后收集細胞，冰磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌細胞，離心加入1x結合緩沖液400μL重懸細胞，加入Annexin-V-FITC 5μL，4℃避光放置15分鐘；加入PI 10μL，4℃避光放置5分鐘，1小時內上流式細胞儀測定細胞的凋亡率。

1.5 Western blot檢測

不同濃度的粉防己堿(5、10、20μg/mL)處理BeWo細胞株24小時，提取蛋白。12%SDS-PAGE電泳后轉膜，5%牛奶室溫封閉1小時，1抗孵育4℃過夜，二抗孵育1小時后采用化學熒光法顯色。GAPDH用做內參。

1.6統計學方法

2結果

2.1粉防己堿對BeWo細胞株增殖的作用

BeWo細胞株用遞增濃度的粉防己堿處理24小時、48小時和72小時，然后采用MTT實驗檢測了增殖抑制率。如圖1所示，5、10、20μg/mL粉防己堿作用24小時后細胞的增值抑制率依次為17.9±0.8、20.9±1.1、27.0±1.4(F=63.118，P<0.01)，48小時依次為22.0±1.0、24.9±1.3、39.1±2.0(F=126.123，P<0.01)，72小時依次為24.9±1.2、29.0±1.3、44.9±2.7(F=129.393，P<0.01)，細胞的增殖抑制率呈現出濃度及時間依賴關系；更高的濃度的粉防己堿伴隨著更高的增殖抑制率(P<0.01)。

圖1 粉防己堿對BeWo細胞增殖抑制的作用

Fig.1 Effect of Tetrandrine on the proliferation inhibition of BeWo cells

2.2粉防己堿對BeWo細胞凋亡的作用

收集了不同濃度粉防己堿處理24小時的BeWo細胞，通過Annexin V-FITC/PI染色我們檢測了粉防己堿處理后BeWo細胞的凋亡情況。結果顯示隨著粉防己堿濃度的增加，凋亡細胞的比例也增加，見圖2。對照組細胞的凋亡比例為3.52%±0.62%；而相對的，由5、10、20μg/mL粉防己堿作用24小時后細胞凋亡的比例依次為8.32%±2.1%、13.45%±2.7%和27.38%±3.1%，差異具有統計學意義(F=41.616，P<0.01)，由此可見絨癌細胞株BeWo細胞凋亡數目的多少與粉防己堿的濃度密切相關。

圖2 粉防己堿對BeWo細胞凋亡的作用

Fig.2 Effect of Tetrandrine on the apoptosis of BeWo cells

2.3 增殖細胞核抗原和Survivin蛋白表達的變化

采用Western blot檢測了粉防己堿處理24小時后BeWo細胞株中相關蛋白的表達，見圖3。不同濃度的粉防己堿處理24小時后，PCNA蛋白表達水平分別為0.85±0.05、0.53±0.04、0.22±0.01、0.03±0.01(F=244.375，P<0.01)，Survivin蛋白表達水平分別為1.06±0.07、0.98±0.06、0.52±0.03、0.39±0.03(F=529.4，P<0.01)，均明顯降低。

圖3 PCNA和Survivin蛋白表達的變化

Fig.3 Expression changes of PCNA and Survivin

3討論

雖然大多數GTT患者對化療敏感，大約90%以上的患者可以通過化療治愈，但是臨床上仍有10%的患者對化療耐藥，因此針對化療耐藥患者，探索新的二線治療藥物就顯得極為重要。

3.1粉防己堿對絨癌細胞增殖和凋亡的影響

中國傳統醫藥的臨床應用歷史悠久，粉防己堿(分子式C38H42N2O6)是粉防己的塊莖中提取的一種生物堿，被認為是一種較為安全的藥物。最近的研究發現粉防己堿具有抗腫瘤作用，其抗腫瘤的機制主要是抑制腫瘤細胞增殖和誘導細胞凋亡[7-8]。但是關于粉防己堿對于絨癌細胞株的作用目前尚未見報道。我們的研究結果顯示粉防己堿可以抑制絨癌細胞株BeWo的增殖，并且促進細胞的凋亡，而且隨著作用時間的延長及濃度的增加效果更加明顯。這些關于粉防己堿誘導細胞毒性和細胞凋亡相關的數據顯示隨著治療時期的延長，粉防己堿的血清水平在微摩爾范圍內已經表現出用于絨毛膜癌的潛在治療價值。

3.2粉防己堿對絨癌細胞增殖和凋亡的作用機制

為了探討粉防己堿抑制絨癌細胞株生長及促進凋亡的機制，我們研究了與癌細胞增殖相關基因表達水平的變化。相應于癌癥細胞生長的藥物誘導的抑制，哺乳動物細胞常常通過激活不同的細胞增殖檢查點，從而對藥物誘導的腫瘤細胞生長抑制做出反應。長期以來PCNA一直被認為是直接反映細胞增殖能力的指標[9]，PCNA 在細胞的G1 期合成逐漸增加，S 期達高峰，G2 期又開始下降，其表達量與DNA 合成量變化一致，在細胞增殖周期中起著重要作用。Survivin 是凋亡蛋白抑制因子(inhibitor of apoptosis proteins，IAPs)家族的成員，具有很強的抑制凋亡的作用。Cai等[10]的研究結果表明，抑制Survivin 的表達有效遏制了腫瘤細胞的生長并誘導其凋亡。本研究結果顯示粉防己堿可以下調PCNA和Survivin的表達量，提示粉防己堿可能通過調控上述基因而抑制絨癌細胞株生長及促進凋亡。

綜上所述，本研究表明粉防己堿在微摩爾濃度范圍內可以表現出對絨癌細胞株BeWo的抗增殖活性，誘導凋亡。在這一過程中，與細胞增殖和凋亡相關聯的重要調控因子PCNA和Survivin的表達量發生了下調。這些數據顯示粉防己堿有望成為GTT化療方案的輔助治療藥物，用于絨毛膜癌的治療。

[1]Seckl M J,Sebire N J,Berkowitz R S.Gestational trophoblastic disease[J].Lancet,2010,376(9742):717-729.

[2]Li X,Xu H,Dai X,etal.Enhanced in vitro and in vivo therapeutic efficacy of codrug-loaded nanoparticles against liver cancer[J].Int J Nanomedicine,2012,7:5183-5190.

[3]Zhu R,Liu T,Tan Z,etal.Tetrandrine induces apoptosis in gallbladder carcinoma in vitro[J].Int J Clin Pharmacol Ther,2014,52(10): 900-905.

[4]Qin R,Shen H,Cao Y,etal.Tetrandrine induces mitochondria-mediated apoptosis in human gastric cancer BGC-823 cells[J].PLoS One,2013,8(10): e76486.

[5]Gao J L,Ji X,He T C,etal.Tetrandrine Suppresses Cancer Angiogenesis and Metastasis in 4T1 Tumor Bearing Mice[J].Evid Based Complement Alternat Med, 2013,2013:265061.

[6]Liu W,Zhang J,Ying C,etal.Tetrandrine combined with gemcitabine and Cisplatin for patients with advanced non-small cell lung cancer improve efficacy[J].Int J Biomed Sci,2012,8(1):28-35.

[7]Gong K,Chen C,Zhan Y,etal.Autophagy-related gene 7 (ATG7) and reactive oxygen species/extracellular signal-regulated kinase regulate tetrandrine-induced autophagy in human hepatocellular carcinoma[J].J Biol Chem,2012,287(42):35576-35588.

[8]Tao L J,Zhou X D,Shen C C,etal.Tetrandrine induces apoptosis and triggers a caspase cascade in U2-OS and MG-63 cells through the intrinsic and extrinsic pathways[J].Mol Med Rep ,2014,9(1):345-349.

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[10]Cai Y,Ma W,Huang X,etal.Effect of survivin on tumor growth of colorectal cancer in vivo[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(10): 13267-13272.

[專業責任編輯：楊文方]

Effects of Tetrandrine on proliferation and apoptosis of human choriocarcinoma BeWo cells

FANG Jing, XUE Yan, AN Rui-fang

(Department of Obstetrics and Gynecology, First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Shaanxi Xi’an 710061, China)

Objective To study the effects of Tetrandrine on proliferation and apoptosis of human choriocarcinoma BeWo cells. Methods BeWo cells were treated with various concentrations of Tetrandrine. MTT and flow cytometry were used to detect the proliferation and apoptosis of BeWo cells at different time. Western blot was used to detect the expressions of PCNA and Survivin. Results After treatment with Tetrandrine in BeWo cells, a concentration- and time-dependent inhibition of cell growth was observed (P<0.01). After 24h treatment of 0, 5, 10 and 20μg/mL Tetrandrine, the apoptosis rate of BeWo cells was 3.52%±0.62%, 8.32%±2.1%, 13.45%±2.7% and 27.38%±3.1%, respectively (F=41.616,P<0.01), the expression of PCNA was 0.85±0.05, 0.53±0.04, 0.22±0.01, 0.03±0.01, respectively (F=244.375,P<0.01), and the expression of Survivin was 1.06±0.01, 0.98±0.06, 0.52±0.03 and 0.39±0.03, respectively (F=529.4,P<0.01).Conclusion Tetrandrine could produce concentration- and time-dependent inhibition and induce apoptosis in human choriocarcinoma BeWo cells, which may service as a cancer chemo-preventive agent for gestational trophoblastic tumor (GTT).

Tetrandrine; choriocarcinoma; proliferation; apoptosis

2016-10-19

陜西省科學技術研究發展計劃國際合作項目(2013KW-27-01)；中央高校基本科研業務費專項資金資助項目(XJJ2015094)

方 靜(1972-)，女，副主任醫師，博士，主要從事婦科腫瘤的研究。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.12.014

R737.3

A

1673-5293(2016)12-1472-03