miRNA-29b在急性冠脈綜合征病人中的表達(dá)水平及意義

陸 爽，李 艷，鄧 虹，林 昕，張明謙

miRNA-29b在急性冠脈綜合征病人中的表達(dá)水平及意義

陸 爽，李 艷，鄧 虹，林 昕，張明謙

目的 探討miRNA-29b在急性冠脈綜合征病人中的表達(dá)水平及意義。方法 選取2013年2月—2014年3月在昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)科及心血管內(nèi)科確診的急性冠脈綜合征病人58例，其中急性心肌梗死(AMI)30例為觀察組，不穩(wěn)定型心絞痛(UA)28例為對照組。同時選取健康體檢者10名作為正常組。發(fā)病后不同時間點位采用微小RNA提取試劑盒對各組觀察對象血漿中RNA進行提取，應(yīng)用RT-PCR及qRT-PCR方法對miRNA-29b表達(dá)水平進行檢測，比較各組表達(dá)差異；結(jié)合各組對象血清細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)含量、增強MRI(DE-MRI)結(jié)果、心律失常發(fā)生情況等闡述其意義。結(jié)果 發(fā)病后1 d、7 d、14 d和30 d，觀察組血漿中miRNA-29b表達(dá)水平顯著低于對照組(P<0.05)，觀察組和對照組miRNA-29b表達(dá)水平均顯著低于正常組(P<0.05)；觀察組和對照組相比較其心肌纖維化發(fā)生、心律失常發(fā)生均顯著增高(P<0.05)。結(jié)論 miRNA-29b表達(dá)水平與急性冠脈綜合征后心肌纖維化及心律失常的發(fā)生具有密切關(guān)系。

急性冠脈綜合征；微小RNA；心肌纖維化；心律失常

急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)是在冠狀動脈粥樣硬化的基礎(chǔ)上，危險因子等多因素作用下出現(xiàn)粥樣斑塊破裂出血，最終導(dǎo)致血栓形成并堵塞管腔，表現(xiàn)以胸痛、休克為臨床特征的一組臨床綜合征，通常分為急性心肌梗死(AMI)和不穩(wěn)定型心絞痛(UA)兩種類型[1]。急性冠脈綜合征發(fā)生后易發(fā)生心律失常及心功能急劇惡化。據(jù)統(tǒng)計，目前盡管冠心病二級預(yù)防藥物已廣泛應(yīng)用于臨床，但每年依然有4%～5%的急性冠脈綜合征病人因發(fā)生心律失常或者心功能惡化而死亡[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)心律失常和心功能進行性惡化與心肌纖維化形成有著密切關(guān)系，其中miRNAs在心肌纖維化形成過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用[3]。本研究針對不同類型的急性冠脈綜合征病人miRNA-29b表達(dá)水平進行檢測、結(jié)合心肌纖維化血清標(biāo)準(zhǔn)物(血清細(xì)胞外基質(zhì))含量測定、增強MRI(DE-MRI)結(jié)果、心律失常發(fā)生情況等臨床資料評價其意義，為改善急性冠脈綜合征的預(yù)后提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年2月—2014年3月在昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)科及心血管內(nèi)科確診的急性冠脈綜合征病人58例，男性38例，女20例，年齡(58.1±6.45)歲。其中AMI 30例為觀察組，UA 28例為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有急性冠脈綜合征病人診斷參照2012年ESC ST抬高急性心肌梗死管理指南和2012年中華醫(yī)學(xué)會非ST抬高急性冠脈綜合征診斷與治療指南診斷標(biāo)準(zhǔn)納入，觀察組及對照組均按照指南推薦給予治療。所有入選個體參與試驗均符合倫理學(xué)規(guī)定。病例排除標(biāo)準(zhǔn)：有近期手術(shù)、創(chuàng)傷、腫瘤、急性感染、先天性心臟病、心肌病、嚴(yán)重肝腎功能不全、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，腦血管意外等疾病[2]。選取健康體檢者10名為正常組，男性5名，女性5名，年齡(59.3±5.62)歲。正常組來自昆明市延安醫(yī)院健康體檢者，滿足臨床資料及影像學(xué)檢查無器質(zhì)性病變，且血糖、血脂正常。

1.2 主要試劑 microRNA快速提取試劑盒(購自北京博凌科為生物科技公司，編號110501)；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒采用Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒采用Takara BIO株式會社熒光定量試劑盒(購自上海拜力生物科技有限公司)；Ⅰ型、Ⅲ型前膠原放免試劑盒和層粘蛋白(LN)和透明質(zhì)酸(HA)放免試劑盒(均購自上海信裕生物科技有限公司)

1.3 試驗方法

1.3.1 miRNA-29b表達(dá)檢測 觀察組和對照組研究對象分別在確診ACS后1 d、7 d、14 d和30 d，應(yīng)用全血(液體樣本)microRNA快速提取試劑盒抽取外周靜脈血標(biāo)本(10～20) mL，根據(jù)產(chǎn)品說明書步驟，進行全血微小RNA提取。提取完畢后用普通瓊脂糖凝膠電泳(電泳條件：膠濃度1.2%；0.51)TBE電泳緩沖液；150 V，15 min)進行RNA完整性檢測。用OD260/OD280比值檢測純度檢測。檢測完畢后應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄處理，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒對miRNA-29b表達(dá)水平進行定量檢測。

1.3.2 血清細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)含量檢測 試驗組及對照組分別在發(fā)病后30 d采集晨起空腹靜脈血10 mL，轉(zhuǎn)速800 r/min離心15 min，靜置分離血清，置于-20℃低溫冰箱中放置備用。血清細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)檢測包含Ⅰ型前膠原(PCⅠ)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、LN、HA。各檢測成分按標(biāo)準(zhǔn)步驟進行加樣、4℃放置過夜后加入分離劑、3 500 r/min離心20 min棄上清后加入放射沉淀物，采用放射免疫測定法進行檢測各成分濃度。

1.3.3 心肌增強MRI(DE-MRI)檢測及心律失常發(fā)生情況監(jiān)測 各組在不同時間點位進行心肌對比劑延遲增強MRI(DE-MRI)檢測了解心肌纖維化情況，應(yīng)用計算機輔助測體積法(CAVM)對纖維化范圍進行測定。各組應(yīng)用24 h動態(tài)心電圖對心律失常發(fā)生情況進行監(jiān)測。

2 結(jié) 果

2.1 總RNA完整性測定及熒光定量PCR產(chǎn)物測定 瓊脂糖凝膠電泳檢測提取總RNA完整性(見圖1)，檢測結(jié)果28 s，18 s ，5 s條帶清晰完整、無擴散現(xiàn)象，用紫外分光光度計測定260 nm和280 nm下的吸光度，結(jié)果顯示OD260/OD280在1.8～2.0，表明RNA完整并具有較好的純度，滿足實驗要求。

圖1 總RNA瓊脂糖電泳圖

2.2 各組miRNA-29b表達(dá)水平對比 觀察組發(fā)病后1 d、7 d、14 d和30 d的血清miRNA-29b表達(dá)水平均顯著低于對照組(P<0.05)；觀察組與對照組發(fā)病后1 d、7 d、14 d和30 d的血清miRNA-29b表達(dá)水平顯著低于正常空白組(P<0.05)。詳見表1。

2.3 各組血清細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)含量檢測 應(yīng)用放射免疫測定法對各組血清外基質(zhì)Ⅰ型前膠原、Ⅲ型前膠原、層粘蛋白和透明質(zhì)酸進行測定，觀察組血清ECM含量較對照組明顯增高(P<0.05)。詳見表2。

表1 各組不同時間點位血清miRNA-29b表達(dá)水平比較(±s)

表2 各組不同時間點位血清ECM含量比較(±s) μg/L

表3 各組不同時間心律失常發(fā)生情況比較 %

2.4 心肌增強MRI(DE-MRI)及心律失常發(fā)生情況監(jiān)測 應(yīng)用心肌對比劑延遲增強MRI(DE-MRI)檢測了解急性冠脈綜合征發(fā)生后心肌纖維化情況，觀察組較對照組心肌纖維化發(fā)生率增加，急性冠脈綜合征發(fā)病后心肌纖維化發(fā)生情況與病情嚴(yán)重程度相關(guān)，且隨疾病時間延長心肌纖維化面積增大(見圖2)。應(yīng)用24 h動態(tài)心電圖檢測觀察組與對照組心律失常發(fā)生情況，發(fā)現(xiàn)觀察組心律失常發(fā)生情況較對照組明顯增加，推測與心肌纖維化有關(guān)(P<0.05)。詳見表3。

圖2 各組不同時間點位心肌對比劑延遲增強MRI計算心肌纖維化體積圖

2.5 miRNA-29b與心肌纖維化體積相關(guān)關(guān)系分析 應(yīng)用Spearman相關(guān)分析對miRNA-29b表達(dá)水平與MRI(DE-MRI) 計算機輔助測體積法(CAVM)對纖維化范圍進行相關(guān)關(guān)系分析(見圖3)，結(jié)果相關(guān)系數(shù)r2=-0.32(P<0.05)。提示miRNA29b與心肌纖維化范圍呈中度負(fù)相關(guān)關(guān)系。

圖3 miRNA-29b表達(dá)量與心肌對比劑延遲增強MRI計算心肌纖維化體積相關(guān)關(guān)系散點圖

3 討 論

目前急性冠脈綜合征嚴(yán)重威脅人類健康，發(fā)病率及死亡率逐年增高，其發(fā)病原因多為急性冠狀動脈狹窄或者突然閉塞，表現(xiàn)為急性心肌缺血為主要特征的臨床綜合征，包括不穩(wěn)定型心絞痛及急性心肌梗死。在急性冠脈綜合征發(fā)生后心律失常和心功能惡化是導(dǎo)致死亡的主要原因。近年來，因持續(xù)心肌缺血導(dǎo)致心肌纖維化形成進而誘發(fā)心律失常和心功能惡化觀點已被廣泛研究[4]。而眾多的證據(jù)表明多種微小RNA(如miR-29、miR-210，miR-302c，miR-185等)參與纖維化形成進程，是調(diào)節(jié)纖維化形成的關(guān)鍵因素之一[5-6]。因此為減少ACS發(fā)生后心肌纖維化的發(fā)生，避免心臟不良事件發(fā)生，改善臨床預(yù)后，對ACS病人血清中miR-29b表達(dá)水平進行檢測，并結(jié)合反應(yīng)組織纖維化程度的血清細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)含量、增強MRI(DE-MRI)結(jié)果、心律失常發(fā)生情況等臨床資料對其臨床意義進行闡述。

本研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-29b在急性冠脈綜合征病人血漿中出現(xiàn)了表達(dá)下調(diào)。同時亦發(fā)現(xiàn)miRNA-29b在急性心肌梗死病人中表達(dá)下調(diào)更為明顯。為明確是否持續(xù)心肌缺血后誘發(fā)心肌纖維化形成，同時驗證miRNA-29b是否與心肌纖維化形成，采用無創(chuàng)性心肌對比劑延遲增強MRI(DE-MRI)檢測驗證心肌纖維化形成情況，并檢測了血清反映心肌纖維化的生物學(xué)指標(biāo)血清細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著心肌缺血嚴(yán)重程度加重和心肌缺血持續(xù)時間的延長，心肌纖維化發(fā)生情況明顯增加，且血清細(xì)胞外基質(zhì)含量明顯增高，提示心肌缺血嚴(yán)重程度及心肌缺血的持續(xù)時間可以導(dǎo)致心肌纖維化的發(fā)生，通過Spearman相關(guān)分析miRNA-29b與心肌纖維化體積變化情況，發(fā)現(xiàn)兩者呈現(xiàn)中度負(fù)相關(guān)，提示miRNA-29b參與了心肌纖維化的形成。分析其結(jié)果可能為持續(xù)心肌缺血導(dǎo)致心肌缺氧，而在低氧環(huán)境下成纖維細(xì)胞可持續(xù)性高表達(dá)膠原蛋白，產(chǎn)生大量膠原蛋白，其中主要成分包括Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白，同時，低氧環(huán)境下可誘導(dǎo)產(chǎn)生TGF-1分泌增加，而TGF-1可通過激活TGF-/Samd信號通路促進Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白沉積，上述變化導(dǎo)致心肌纖維化形成及瘢痕增生[7-8]。而miRNA-29b對于TGF-1有明顯抑制作用[9]，當(dāng)miRNA-29b低表達(dá)時，可以導(dǎo)致其對TGF-1分泌調(diào)節(jié)失調(diào)，從而引起成纖維細(xì)胞膠原代謝紊亂，最終導(dǎo)致心肌纖維化形成。研究發(fā)現(xiàn)，隨急性冠脈綜合征病人發(fā)病后心律失常發(fā)生隨心肌纖維化的形成增加，分析其原因是由于心律失常發(fā)生與心臟結(jié)構(gòu)重構(gòu)和電重構(gòu)密切相關(guān)，而心肌纖維化的發(fā)生改變了心臟電傳導(dǎo)和興奮，導(dǎo)致心臟興奮性傳導(dǎo)不一致[10]，同時心肌纖維化形成區(qū)域異位起搏點興奮性增加，上述原因均導(dǎo)致心律失常發(fā)生。

miRNA-29b在急性冠脈綜合征病人血清中表達(dá)下調(diào)，且與心肌纖維化發(fā)生密切相關(guān)，誘導(dǎo)心律失常發(fā)生。今后有必要進一步研究miRNA-29b的表達(dá)情況及其調(diào)控機制，對減少急性冠脈綜合征病人心肌纖維化的形成，改善其預(yù)后提供實驗室資料。

[1] 賴桂鳳，黃海英，陸夏凱，等.急性冠脈綜合征的急救護理研究現(xiàn)狀[J].臨床護理雜志，2015(3)：48-50.

[2] Dash D-Current Status of antiplatelet therapy in acute coronary syndrome[J].Cardiovasc Hematol Agents Med Chem，2015，13(1)：40-49.

[3] Fichtlscherer S，de Rosa S，F(xiàn)ox H，et al.Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease[J].Circ Res，2010，107：677-684.

[4] 張召才，楊英珍，陳灝珠，等.心肌纖維化的研究進展[J].臨床心血管病雜志，2004，20(1)：58-60.

[5] 余華東，佘強.心肌梗死中微小RNA的研究進展及臨床應(yīng)用前景[J].重慶醫(yī)學(xué)，2014(19)：2514-2517.

[6] 李勤，王玉明，段勇，等.miRNAs與心血管疾病[J].現(xiàn)代檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2014，29(2)：22-25.

[7] 陳蓉，謝梅林.TGF-β/Smads信號通路在心肌纖維化發(fā)生和治療中應(yīng)用前景的研究進展[J].中國藥理學(xué)通報，2012，28(9)：1189-1192.

[8] 高淑卿，朱鵬立.心肌纖維化的研究進展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2009，15(11)：1627-1629.

[9] Villarreal G，Oh DJ，Kang MH，et al.Coordinated regulation of extracellular matrix synthesis by the microRNA-29 family in the trabecular meshwork[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2011，52(6)：3391.

[10] 邢曉倩，徐健，蘇浩，等.犬心房顫動模型縫隙連接蛋白40、45與心肌纖維化的相關(guān)性[J].中華心血管病雜志，2011，39(2)：176-180.

(本文編輯王雅潔)

昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院(昆明 650051)

張明謙，E-mail：gg7944@sina.com

R541.4 R256.2

B

10.3969/j.issn.1672-1349.2016.24.027

1672-1349(2016)24-2932-04

2016-01-15)

引用信息：陸爽，李艷，鄧虹，等.miRNA-29b在急性冠脈綜合征病人中的表達(dá)水平及意義[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2016，14(21)：2932-2935.