左西孟旦對心力衰竭大鼠離體心臟的保護作用及機制研究

張小龍

左西孟旦對心力衰竭大鼠離體心臟的保護作用及機制研究

張小龍

目的 觀察左西孟旦對心力衰竭大鼠離體心臟功能的影響，并探討其作用機制。方法 采用腹主動脈縮窄法制作大鼠心衰模型，使用Langendorff離體心臟灌流實驗方法，觀察左西孟旦對心力衰竭大鼠離體心臟功能的影響，運用不同阻斷劑干預后，觀察左西孟旦作用的變化。結果 左西孟旦可增強心力衰竭大鼠離體心臟功能，其心率減慢，LVSP-LVDP升高，+dP/Dtmax升高，-dP/Dtmax降低，L-NAME、Gli預處理后，左西孟旦對心力衰竭心臟功能的作用減弱。結論 左西孟旦可以明顯改善心力衰竭大鼠離體心臟功能，其作用可能與NO的合成、KATP通道開放有關。

左西孟旦；心力衰竭；離體心臟；心功能

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)嚴重威脅著人類的健康，它的發病率呈逐年上升趨勢，在中國，成年人心衰的患病率約為0.9%，隨著老齡化社會的發展，人群中心衰患者人數不斷增加。它是缺血性心臟病、高血壓病、心肌病、瓣膜性心臟病等各種病因所致心血管疾病發展的最終結局。目前雖然在臨床和基礎研究方面對CHF的防治取得了一系列重大進展，但是CHF的患病率與死亡率不降反升，5年生存率仍然低于50%。因此基于CHF的研究，特別是臨床藥物的研究仍然有重要的意義。左西孟旦(levosimendan，Levo)是一種新型強心藥物，它通過增加心肌肌鈣蛋白對Ca2+的敏感性發揮增強心功能作用，臨床中主要用于心臟功能衰竭的治療和有高手術風險或左心室功能損傷病人的支持性治療或心外科手術選擇性治療[1- 2]，但是無論基礎還是臨床研究，其對心臟作用靶點的研究較少。本實驗采用腹主動脈縮窄法制作大鼠心衰模型，使用Langendorff離體心臟灌流實驗方法，觀察Levo對心力衰竭大鼠離體心臟功能的影響，并探討其可能的作用靶點。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑 左西孟旦注射液(Levosimendan，Levo，規格為5 ml：12.5mg)，齊魯制藥有限公司，批號512007F3，左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME)、吲哚美辛(Indo)、四乙胺(Tetraethtylamine，TEA)、格列苯脲(Glibenclamide，Gli)、氯化鋇(BaCl2)、4-氨基吡啶(4-aminopyridine，4-AP)均購自Sigma公司。其余均為化學試劑國產分析純。

1.1.2 儀器 Langendorff心臟灌流裝置，Powerlab生物信號采集分析系統購自澳大利亞ADInstruments公司，恒流泵購自蘭格恒流泵有限公司，超級恒溫器購自上海儀典儀表電子有限公司。

1.2 實驗動物 健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，購自山西醫科大學實驗動物中心，體重為180 g～220 g。飼料由山西醫科大學實驗動物中心提供，每籠飼養大鼠5只，室溫保持在20 ℃～25 ℃，相對濕度50%左右，大鼠適應性喂養1周后開始實驗。將大鼠分為對照組6只、假手術組6只、心衰組50只。

1.3 制備心力衰竭大鼠動物模型

1.3.1 模型制備 心力衰竭模型制備采用腹主動脈縮窄法[3]：健康雄性 Wistar 大鼠，體重180 g～220 g，用40 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，四肢及頭部固定于手術臺上，開腹，止血鉗鈍性分離腹壁肌層，分離腎動脈分支稍上處的腹主動脈，7號針頭平行腹主動脈，用線結扎此動脈及針頭后，拔出針頭，使腹主動脈面積為原面積的40%，假手術組分離動脈后只穿線，不接扎，逐層關閉腹腔，術后肌注3 d青霉素以防感染，每天200 U。

1.3.2 模型評價 每天早、 中、 晚觀察大鼠精神狀態、 活動情況、 皮毛變化、 飲食情況及呼吸頻率。12周后表現出明顯的CHF體征：表現精神狀態差，眼瞼分泌物增多，活動能力下降，活動逐漸減少，進食減少，被毛松軟，脫毛，呼吸加快，喜歡聚團等。對大鼠進行心功能測定：隨機取大鼠，稱重記錄體重(BW)g后麻醉動物，麻醉動物后分離右頸總動脈切開后插入直徑 1 mm且有1%肝素的心導管，接BL-420S生物機能分析系統，緩慢推進同時觀測動脈壓，描記記錄血壓曲線。再繼續插入，使其通過主動脈瓣進入左心室，描記記錄左心室內壓(LVP)、心臟舒張期左室內壓變化最大速率(±dp/dtmax)等。比較對照組、假手術組和心衰組心功能變化。實驗結束后將心臟置于預先備好的4℃的臺氏液中。從臺氏液中取出心臟，用雙層濾紙吸干水分，用電子天平準確稱量全心濕重(HW)g；去除心房及瓣膜組織用電子天平稱心室濕重(VW)g。最后所稱得的結果計算出心臟重量指數(HW/BW)mg/g和心室重量指數(VW/BW)mg/g。比較對照組、假手術組和心衰組的HW/BW和VW/BW。

1.4 離體心臟的制備 大鼠頸總動脈插管，心功能測定結束后，開胸解剖取出心臟，置入4℃臺氏液中，去除其余組織后置于Landendorff灌流裝置上，用充以95%氧氣和5%二氧化碳的臺氏液灌流(臺氏液成分：NaCl 140mmol/L，MgCl21.0 mmol/L，KCl 5.4 mmol/L，Glu 10 mmol/L，NaH2PO40.33 mmol/L，CaCl21.8 mmol/L，HEPES 5.0 mmol/L)，用NaOH調節pH值至7.36。起搏電極位于右室，刺激強度設定為二倍閾強度，刺激頻率為每分鐘200次。將一直徑約4 mm、充有一定臺式液的乳膠水囊經由左心房插入至左心室內，水囊導管的一端與壓力換能器連接，將灌流速度調整為10 mL/min，對室內壓進行測定。擬測定指標為：心率(HR)，左室收縮壓(LVSP)，左室舒張壓(LVDP)，左室壓最大上升速率(+dP/Dtmax)，左室壓最大下降速率(-dP/Dtmax)，主動脈收縮壓(LVSP-LVDP)。以主動脈收縮壓≥8 kPa；為灌流成功標志，穩定60 min，待所觀察各心功能指標維持穩定后，開始干預。

1.5 實驗方法

1.5.1 Levo對心力衰竭離體心臟的作用 抽取心力衰竭大鼠10只，隨機分為空白組和Levo組各5只?？瞻捉M持續灌流臺式液至實驗結束，Levo組往灌流液中加入Levo，使灌流液中Levo的終濃度為0.3 μmol/L。觀察兩組大鼠離體心臟的HR、LVSP、LVDP、+dP/Dtmax、-dP/Dtmax等心臟功能指標的變化情況。

1.5.2 不同阻斷藥對Levo作用的影響 將35只心肌肥厚大鼠隨機分為7組，每組5只，Levo組和Levo+阻斷藥組(n=5)，6種阻斷藥分別為NO合酶(eNOS)抑制劑L-NAME(1×10-4mol/L)、環氧合酶(COX)抑制劑Indo(1×10-5mol/L)、KV通道阻斷劑4-AP(1×10-3mol/L)、KATP通道阻斷劑Gli(1×10-5mol/L)、KCa通道阻斷劑TEA(1×10-2mol/L)、KiR通道阻斷劑BaCl2(1×10-3mol/L)。待離體心臟灌流穩定后，Levo組加入Levo終濃度為0.3 μmol/L的臺式液，阻斷藥組則加入阻斷劑孵浴10 min后，再加入Levo終濃度為0.3 μmol/L的臺式液，觀察Levo對心力衰竭離體心臟的作用。

2 結 果

2.1 大鼠心力衰竭模型制備鑒定 12周末，心衰組動物死亡5只，假手術組死亡1只。大鼠心功能測定結果及心臟、心室重量指數計算結果顯示(見表1、表2)，大鼠心衰模型成功制備。

表1 各組大鼠心功能結果比較(±s)

表2 各組大鼠HW/BW和VW/BW結果比較(±s)

2.2 Levo對心衰大鼠離體心臟功能的影響 與空白相比，Levo可增強衰大鼠離體心臟心功能。心率減慢(P<0.01)，LVSP-LVDP升高P<0.05)，+dP/Dtmax(P<0.01)升高，-dP/Dtmax降低(P<0.01)，差異有統計學意義。詳見表3。

表3 空白組、Levo組心衰大鼠離體心臟心功能指標比較(±s)

2.3 不同阻斷藥對Levo改善心功能作用的影響 L-NAME及Gli孵浴后，Levo對離體心臟功能增強作用減弱，與Levo組比較，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)；其余阻斷藥孵浴后，Levo對離體心臟功能影響與Levo組比較，差異無統計學意義。詳見表4。

表4 Levo組與阻斷藥組心力衰竭大鼠離體心功能指標比較(±s)

3 討 論

腹主動脈縮窄法所致大鼠心衰模型是慢性心力衰竭研究中常用的動物模型，其發病機制明確，程度基本相同，與臨床心衰病人的病理變化過程類似。腹主動脈縮窄可以使左心室流出道受阻，后負荷加重而致心力衰竭。本實驗制作腹主動脈縮窄法所致的大鼠心衰模型，12周后，大鼠心力衰竭模型成功建立，各心功能指標明顯降低。

Langendorff離體心臟灌流模型是研究心血管疾病的成熟裝置。離體實驗的優勢在于它排除了神經、內分泌、體液因素以及心臟前、后負荷對心功能的影響，可以直觀觀察藥物對心功能的影響。本研究的實驗指標HR、LVSP、LVDP、±dP/Dtmax是離體心臟灌流中反映心臟收縮與舒張功能的重要指標，HR是反映心臟收縮舒張功能最簡單直觀的指標，心率減慢，心輸出量減少可使血壓降低，心率減慢，從而使冠脈灌流時間增多，最終使心肌得到更多的血液供應，對心臟起保護作用。LVSP和+dP/Dtmax主要反映心臟的收縮功能，LVDP和-DP/Dtmax主要反映心臟的舒張功能[4]。Levo作為新一代Ⅱ型Ca2+增敏劑，不同的濃度下具有Ca2+增敏、抑制磷酸二酯酶、抗炎抗氧化等作用[5- 6]。本研究結果表明，和空白組相比，Levo可以使心力衰竭大鼠心率減慢，-DP/Dtmax降低，LVSP-LVDP、+dP/Dtmax則升高，上述心功能指標表明，Levo可顯著增強心力衰竭大鼠離體心臟的心功能。

心臟代謝產生的物質以及心臟細胞的蛋白、通道可以通過調節心臟收縮和舒張來影響心功能。例如一氧化氮(NO)、前列環素(PGI2)、K+通道等。NO可通過NO-sGC-cGMP 途徑，使sGC激活促使cGMP 生成，后者則進一步作用于cGMP依賴性蛋白激酶使Ca2+內流減少，增加Ca2+-ATP酶對Ca2+的攝取，或直接使收縮蛋白去磷酸化而影響心功能。PGI2是由COX催化花生四烯酸產生的，可舒張冠脈改善心功能。K+通道在調節心臟收縮與舒張中具有重要作用，激活心臟的 K+通道，舒張冠狀動脈，可以明顯改善心功能[7]。運用L-NAME、Gli預孵心衰心臟后，和單純灌流Levo離體心臟相比，心率加快，LVSP-LVDP降低，+dP/Dtmax降低，-dP/Dtmax升高，實驗結果提示，NO與KATP通道可能參與了Levo改善心臟收縮舒張功能。

Levo的基礎和臨床研究雖然有了很大的進展，但是其詳細作用機制及作用靶點尚不明確。本研究運用離體心衰模型的方法闡明了Levo可以明顯改善心力衰竭大鼠離體心臟功能，其作用可能與NO的合成、KATP通道開放有關。

[1] Stocker CF，Shekerdemian LS，Norgaard MA，et al .Mechanisms of a reduced cardiac output and the effects of milrinone and levosimendan in a model of infant cardiopulmonary bypass [J]. Critical Care Medicine，2007，35(1): 252-259.

[2] Eriksson HI，Jalonen JR，Heikkinen LO，et al.Levosimendan facilitates weaning from cardiopulmonary bypass in patients undergoing coronary artery bypass grafting with impaired left ventricular function [J]. The Annals of thoracic surgery，2009，87(2): 448-454.

[3] 王敬萍，馬秀瑞，張月安，等. 抗β3腎上腺素能受體抗體對心力衰竭大鼠心臟有保護作用 [J]. 中華心血管病雜志，2014，42(5): 424-427.

[4] JI DB，Zhang LY，Li CL，et al.Effect of hydroxysafflor yellow a on human umbilical vein endothelial cells under hypoxia [J]. Vascular Pharmacology，2009，50(3-4): 137-145.

[5] Kivikko M，Antila AS，Eha J，et al.Pharmacodynamics and safety of a new calcium sensitizer，levosimendan，and its metabolites during an extended infusion in patients with severe heart failure [J]. Journal of Clinical Pharmacology，2002，42(1): 43-51.

[6] 杜賀，史承勇，陳少萍. 左西孟旦的研究新進展 [J]. 中國循環雜志，2014，(7): 555-557.

[7] Jackson WF.Ion channels and vascular tone [J]. Hypertension (Dallas，Tex:1979)，2000，35(1 Pt 2): 173-178.

(本文編輯王雅潔)

山西省心血管病醫院(太原 030024)，E-mail：19941680961@qq.com

引用信息：張小龍.左西孟旦對心力衰竭大鼠離體心臟的保護作用及機制研究 [J].中西醫結合心腦血管病雜志，2016，14(24)：2896-2899.

R541.4 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2016.24.014

1672-1349(2016)24-2896-04

2016-09-09)