熱休克蛋白60聯合銀杏葉提取物對動脈粥樣硬化大鼠血中調節性T細胞含量及主動脈根部巨噬細胞CD36表達的影響

段虎斌，郝春艷，劉翠明，劉學軍

熱休克蛋白60聯合銀杏葉提取物對動脈粥樣硬化大鼠血中調節性T細胞含量及主動脈根部巨噬細胞CD36表達的影響

段虎斌，郝春艷，劉翠明，劉學軍

目的 研究聯合使用熱休克蛋白60(HSP60)及銀杏葉提取物(GBE)對動脈粥樣硬化(AS)大鼠血中調節性T細胞(Treg)含量及主動脈根部巨噬細胞CD36表達的影響。方法 取出生后30 d(1月齡)SD雄性大鼠50只，體重100 g±10 g。隨機分為5組：健康對照組(C組)，AS未干預組(A組)，HSP60干預組(H組)，銀杏葉提取物干預組(G組)，聯合干預組(H+G組)，以上每組10只。實驗采用高脂飼料造 AS 模型，于出生后150 d(即高脂飲食后120 d)各組停止高脂飲食，H組開始用HSP60灌胃，G組用GBE灌胃，H+G組用HSP60及GBE灌胃；于大鼠 180 日齡時采血并取大鼠主動脈根部后處死，通過用流式細胞技術檢測各組血中Treg細胞的含量，免疫組化檢測各組大鼠主動脈根部巨噬細胞CD36表達情況。結果 高脂飲食實驗組主動脈內膜增厚，平滑肌細胞增生，排列紊亂，泡沫細胞浸潤，肌纖維斷裂；各組血清總膽固醇(TC)在180 d時較30 d時有明顯升高，依次為A組、H組、G組、H+G組、C組；A組和H組之間差別無統計學意義(P>0.05)，但較G組、H+G組、C組升高均明顯(P<0.05)，H+G組和G組二者之間差別無統計學意義(P>0.05)，但較C組為高，較A組和H組為低(P<0.05)；C組、A組、H組、G組、H+G組各組血中Treg細胞含量分別為(2.53±0.30)%，(1.64±0.29)%，(3.39±0.31)%，(1.70±0.25)%，(3.58±0.35)%，各組主動脈根部巨噬細胞CD36表達情況為：7.03±1.41，20.95±2.19，13.51±1.10，14.98±1.61，10.68±1.03。結論 口服熱休克蛋白可以誘導免疫耐受，減輕內膜炎癥，穩定斑塊，阻止內膜增厚，銀杏葉提取物活血化瘀，通絡止痛，斂肺平喘，化濁降脂，減少脂質斑塊的形成，減輕內膜炎癥和內膜增厚，二者聯合使用可以通過誘導免疫耐受和降脂，進一步減少內膜炎癥反應，最終達到增強改善AS病變程度的效果。

動脈粥樣硬化；熱休克蛋白60；銀杏葉提取物；調節性T細胞；巨噬細胞CD36

動脈粥樣硬化(AS)可以造成血管狹窄或阻塞導致組織器官缺血缺氧或壞死，是嚴重危害健康的“殺手”[1]。治療AS的藥物有多種，主要包括西藥(如阿托伐他汀類藥物等)和中藥(如銀杏葉提取物等)。多位學者提出通過調節自身免疫可改善血管內膜炎癥達到治療AS的目的[2-3]。本研究探討聯合使用熱休克蛋白60(heat shock protein 60，HSP60)及銀杏葉提取物(Ginkgo biloba extract，GBE)，中西醫結合治療AS的機制。

1 材料與方法

1．1 試劑儀器 GBE(每支17．5 mg/mL，含24%銀杏黃酮苷，3．1%銀杏內酯，2．9%白果內酯，德國威瑪舒培博士藥廠生產)，HSP60 抗原(中國 北京博奧生生物技術公司)豬膽固醇每瓶25 g/瓶(中國 天津大茂化學試劑廠)，豬膽鹽每瓶10 g(中國 上海江萊生物科技有限公司)，丙基硫氧嘧啶每瓶100 g(中國 蘇州東瑞制藥有限公司)，豬油(自購)，基礎飼料(山西醫科大學實驗動物中心提供)維生素D3粉劑(飼料級)50萬U/g(浙江花園生物高科股份有限公司)，注射維生素D3針劑1 mL：7.5 mg，30萬單位(中國 江蘇吳中實業股份有限公司蘇州第六制藥廠)，CD4FITC、CD25 APC、FOXP3 PE(美國 BDFarmige公司)；PV-6001二步法免疫組化試劑盒(中國 北京中杉金橋生物技術公司)；全自動多功能生化分析儀(日本羅氏Hitach公司)，MIAS-2000圖像分析系統(中國 四川川大智勝軟件股份有限公司)，流式細胞儀(型號：FACS Calibur.美國Becton-Dickinson，B-D公司)。

1．2 動物分組與給藥方案 取出生后30 d(1月齡)SD雄性大鼠50只(山西醫科大學實驗動物中心提供)，體重100 g±10 g。隨機分為5組：健康對照組(C組)，AS未干預組(AS組)，HSP60干預組(H組)，銀杏葉提取物干預組(G組)，聯合干預組(H+G組)，以上每組10只。 C組喂飼普通飼料，AS組、H組、G組、H+G組喂飼高脂飼料(2%膽固醇，0.2%豬膽鹽，0.2%丙基硫氧嘧啶，10%豬油，87.6%基礎飼料)和維生素D3粉劑(1.25×106U/kg飼料)120 d，建立AS大鼠模型，實驗開始時于右下肢肌內注射維生素D3針劑(3×105U/kg體重)，每隔30 d一次，動物自由飲水；于出生后150 d(即高脂飲食后120 d)各組停止高脂飲食，H組開始用HSP60(HSP60 10 μg溶于500 μLPBS液)灌胃，G組開始用GBE溶液400 μL(含GBE0．7 mg)和100 μLPBS液灌胃，H+G組用HSP60溶液(10 μg溶于100 μLPBS液)及GBE溶液400 μL共500 μL灌胃， C組、AS組仍以500 μLPBS液灌胃，每日一次，5個組均灌胃30 d，期間均采用普通飼料喂養；于出生后180 d統一眼眶動脈和靜脈采血后處死，取大鼠主動脈根部標本。流式細胞技術檢測血中 CD4+CD25+Foxp3+調節性 T 細胞(Treg)含量。免疫組織化學(IHC)檢測主動脈根部CD36表達情況。

1.3 制作標本 石蠟切片后采用圖像分析系統照相分析，觀察各組大鼠主動脈病理改變，計算血管內膜(IT )與血管內徑(ID )之比( IT / ID )。

1.4 免疫組化檢測 采用PV-6001二步法免疫組織化學檢測試劑盒(北京中山金橋生物技術公司)。用0．01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH6．0)，高壓熱修復；過氧化氫孵育；加兔抗大鼠CD36(北京博奧生生物技術公司)4℃過夜。使用效價為1∶200。次日加辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗兔IgG抗體一HRP多聚體，37℃孵育30 min：二氨基聯苯胺(DAB)顯色，顯微鏡下控制顯色時間。采用MIAS—2000型圖像分析系統拍照，檢測每個高倍視野(40×10)的目標平均灰度(Co)、視場平均灰度(Gv)和面積密度(AAR)，計算陽性單位(PU)，即Pu=[|Go—Gv|×100]/[(1-AAR)×Gmax]，其中Gmax為最大灰度(255)。

1.5 血脂檢測 采用酶比色法(GPO-PAP)，嚴格按照試劑盒說明方法操作，取血清標本10 μL加入工作液1 mL，充分混勻各試劑管，37℃保溫10 min，以試劑空白管較零，讀取505 nm下的標準管和樣品管吸光度。由公式計算其濃度。計算公式：血清總膽固醇濃度=樣品管吸光度/標準管吸光度(mg/dL)

1.6 流式細胞儀( FCM )檢測 流式細胞儀用前向角( Fsc )測向角( Ssc )設二維點圖，用 Gate1 將淋巴細胞圈住，檢測Gate1內細胞 10 000 個。獲取熒光信號并分析數據，軟件均使 用CELLQUEST 軟件，用對數方式分別以 FL1 FL3，FL2 FL3作二維點圖，檢測 CD4、 CD25、 Foxp3 陽性率。

2 結 果

2.1 血脂檢測結果(見表1) 各組血清總膽固醇(TC)在180 d時較30 d時有明顯升高，依次為A組、H組、G組、H+G組、C組；A組和H組之間差別無統計學意義(P>0.05)，但較G組、H+G組、C組升高均明顯(P<0.05)，H+G組和G組二者之間差別無統計學意義(P>0.05)，但較C組為高，較A組和H組為低(P<0.05)。

表1 各組不同時間血清總膽固醇水平比較(±s) mg/dL

2.2 蘇木精-伊紅染色(HE)染色結果 正常對照組大鼠主動脈光鏡下見內皮細胞完整，內膜光滑，外膜、中膜和內膜分界清楚，中膜主要由呈同心排列的彈性纖維膜組成，基質內可見環形平滑肌細胞，內膜較薄，為疏松結締組織，內含少量平滑肌細胞。高脂飲食實驗組可形成AS斑塊，AS組主動脈內膜增厚，平滑肌細胞增生，排列紊亂，部分血管內膜突起，淋巴細胞、炎性細胞、泡沫細胞浸潤，肌纖維斷裂，斑塊形成斑塊處可形成夾層動脈瘤，甚至斑塊有破裂出血。各組主動脈血管內膜厚度與內徑的比值。實驗組主動脈血管內膜厚度與內徑的比值較對照組均高(P<0.05)； H組、G組、H+G組較動脈粥樣硬化未干預組(A組)IT/ID值為低(P<0.05)；但H組和G組之間差異無統計學意義(P>0.05)，二者較H+G組均高(P<0.05)。詳見表2。

表2 主動脈血管內膜厚度與內徑比值(±s) %

2.3 免疫組織化學結果 實驗組較對照組CD36、NF-κB表達增高(P<0.05)，干預組(H組、G組、H+G組)較A組表達均低(P<0.05)，H組、G組較H+G組為高(P<0.05)，但H組、G組之間差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表3。

表3 各組主動脈CD36和NF-κB表達情況(陽性單位，Pu值) (±s)

2.4 流式細胞儀檢測各組外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞含量 A組和G組CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+T細胞比例較對照組(C組)為低(P<0.05)，但A組與G組之間差異無統計學意義(P>0.05)，H+G組和H組較C組、A組和G組為高(P<0.05)，但H+G組和H組之間差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表4。

表4 各組外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞含量(±s)

3 討 論

GBE是一種作用廣泛的天然藥物，其有效成分主要為黃酮苷類和銀杏內酯類化合物，具有保護血管內皮細胞，拮抗血小板活化因子，擴張血管，改善血液循環等多種作用；此外，GBE還可以改善血液流變學、降低血液黏度，目前臨床上廣泛應用于心腦血管疾病的治療，如缺血性心臟病、腦損傷、血管痙攣等[4-5]。

HSP60是一種主要由受刺激以及死亡的內皮細胞分泌和釋放的蛋白，在動脈內皮細胞受外界因素如應激、高血壓、感染等刺激時，可引起HSP60的表達，被樹突狀細胞、淋巴細胞所識別，從而觸發自身免疫反應[6]。Xu等[7]調查發現，越來越多的證據表明HSP60與AS密切相關。

近年來，有研究通過口服抗原和口服芳香烴受體配體誘導叉頭蛋白P3(Forkhead box p3，Foxp3)誘導型調節性T細胞(induced Treg，iTregs)，可改善自身免疫性疾病和炎癥性疾病動物模型的病情[8]。本研究通過口服HSP60抗原和銀杏葉提取物，中西醫結合干預動脈粥樣硬化血管內膜炎癥和增厚情況。

[1] Scherer DJ，Psaltis PJ. Future imaging of atherosclerosis： molecular imaging of coronary atherosclerosis with (18)F positron emission tomography[J].Cardiovasc Diagn Ther，2016，6(4)：354-367.

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(本文編輯王雅潔)

山西省衛計委科技攻關項目(No.201301068 )；山西省自然基金面上項目(No.201601D011119)；山西省歸國留學基金項目(No.2011-096)；山西省基礎研究計劃(No.2010021034-4)

山西醫科大學第一醫院(太原 030001)

郝春艷，E-mail：haochunyan 68@126.com

R285.4

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2016.24.013

1672-1349(2016)24-2893-04

2016-10-10)

引用信息： 段虎斌，郝春艷，劉翠明，等.熱休克蛋白60聯合銀杏葉提取物對動脈粥樣硬化大鼠血中調節性T細胞含量及主動脈根部巨噬細胞CD36表達的影響[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2016，14(24)：2893-2896.