羊痘的診斷與疫苗研究進展

李 楊，顏新敏，吳國華，李 健，葉奕優，趙志荀，朱海霞，張志東，張 強

(1．中國農業科學院蘭州獸醫研究所 家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730046; 2．深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心，廣東 深圳 518045)

羊痘的診斷與疫苗研究進展

李 楊1，顏新敏1，吳國華1，李 健1，葉奕優2，趙志荀1，朱海霞1，張志東1，張 強1

(1．中國農業科學院蘭州獸醫研究所 家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730046; 2．深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心，廣東 深圳 518045)

羊痘病毒粒子大小約為150 Kbp，分子量約為73～91 MDa。該病毒能引起羊的急性、熱性、接觸性傳染病，因其病毒結構及其發病癥狀和人類的天花很像，又稱“羊天花”。根據分離的毒株不同，羊群的發病率為75%～100%，死亡率在10%～58%。目前沒有特效治療藥，只有通過實驗室診斷和免疫預防來減少疾病的發生。

1 血清學診斷

瓊脂免疫擴散試驗(AGPT): 早在1963年Bhalnbani和krish就應用同源或異源血清通過瓊脂擴散試驗對羊痘病進行診斷［1］，但是存在羊痘和傳染性膿皰性皮炎(CPD)的抗原交叉反應。1986年對常規的AGPT做了改進，采用S35蛋氨酸標記抗原，提高了檢測的靈敏度。

對流免疫電泳(CIEP): 1985年建立了對流免疫電泳快速診斷綿羊痘的方法，CIEP在檢測感染組織和細胞中的特異性抗原比AGPT敏感和快速。1999年Rao等［2］設計電泳時用巴比妥緩沖液代替普通的鹽溶液極大地提高了CIEP的敏感性。

熒光抗體技術(FAT): 1986年Soman等通過FAT對感染羊腎細胞和睪丸細胞的羊痘病毒抗原進行檢測［3］。此方法快速簡單，在抗原感染14～24 h之間就能被檢測到。也能夠檢測到感染動物水皰瘡液、皮膚、LK和LT細胞中的羊痘病毒抗原。

血凝試驗(Hemagglutination Test，HT): 羊痘病毒因對動物紅細胞不產生凝集作用，用致敏的綿羊紅細胞來進行血凝試驗。1989年，Joshi等通過將羊痘抗體連接到葡萄球菌A蛋白(SPA)上，成功的建立了檢測羊痘的協同凝集試驗。2005年，王開功等［4］采用兔抗山羊痘病毒IgG致敏綿羊紅細胞建立的反向間接血凝試驗，對山羊痘病毒抗原具有特異性和敏感性，對疫區采集的山羊痘待檢抗原的檢測結果表明，反向間接血凝法的敏感性比瓊脂免疫擴散試驗高。

酶聯免疫吸附試驗(ELISA): ELISA是抗原抗體反應與酶促反應相結合的一種技術，因其快速、便利、特異性強等特點被應用于羊痘病的診斷。1988年，Sharma等［5］首次將ELISA用于山羊痘病毒的檢測，通過用活的和滅活的抗原與高免血清檢測山羊痘的血清與抗體，但是實驗背景高，且假陽性結果較高。隨后應用皮膚活檢建立了免疫捕獲ELISA，該方法特異性能達到80%～100%，敏感性能達到70%～86%。1998年，建立了檢測山羊痘病毒的dot-ELISA檢測方法，通過dot-ELISA和CIEP兩種方法對西孟加拉的38個疑似羊痘病毒感染的樣品進行檢測，結果顯示dot-ELISA方法能檢出28份陽性，檢出率為68.4%，而CIEP能檢出21份陽性，檢出率為55.3%。用已知的陽性樣品作對照，dot-ELISA顯示100%的相關性，CIEP只有80%。dot-ELISA有較高的敏感性和特異性，并能用于野外診斷。2008年吳國華等［6］建立了羊痘病毒雙抗體夾心ELISA檢測方法，用該方法檢測羊傳染性膿皰病毒和口蹄疫病毒，顯示無交叉反應，具有較高的特異性，與瓊脂擴散試驗對比，其敏感性高4～8倍，可用于對山羊痘病毒和綿羊痘病毒的檢測。

2 分子生物學診斷

基于臨床癥狀和血清學的診斷并不總是可靠的，所以為了克服這些限制，簡單、快速、特異地PCR技術成為檢測羊痘病毒并區分LSDV的有效手段。根據羊痘病毒的衣殼蛋白P32基因序列設計了相應的引物，分別建立了檢測羊痘的PCR方法，成功的從樣品中擴增出目的條帶。Markoulatos針對SPPV的ITR和α微管蛋白基因設計2對引物，建立了用于檢測皮膚組織中SPPV的多重PCR技術，該方法敏感性和特異性較好，24 h內就可作出檢測，但偶爾會出現假陰性結果。Hosamani根據山羊痘病毒和綿羊痘病毒P32基因序列的差異，建立了區分GTPV和SPPV的聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性分析技術(PCR-RFLP)。2010年，Lamien根據G蛋白偶聯趨化因子受體基因建立了q-PCR方法，該方法使用雙雜交探針，根據熒光溶解曲線，可以種屬鑒別及基因分型。2008年，韓若嬋等［7］根據P32基因和末端反向重復序列基因片段設2對引物，建立多重PCR檢測方法，用此方法檢測口蹄疫病毒和羊口瘡病毒，結果均為陰性。2014年，趙志荀等［8］基于羊痘病毒的保守序列ITR設計三套引物，建立了區分綿羊痘和山羊痘的環介導等溫擴增技術(LAMP)，并對48份綿羊痘感染樣品和87份山羊痘感染樣品進行檢測，檢出率分別為100%和98.8%。

3 疫苗及免疫

3.1 血清接種 用發病并恢復健康的羊的血清或者抗羊痘病毒的血清接種羊，但是，其溫和的保護和血清免疫的失敗、致敏淋巴細胞，使之不能作為長期有效的免疫方法。

3.2 弱毒疫苗 1957年，我國袁慶志等［9］等通過將綿羊痘病毒在綿羊與雞胚之間交替傳代，使病毒毒力減弱，并保持了良好的免疫原性。目前我國使用最多的仍然是沈榮顯分離的山羊痘病毒太原株經雞胚減毒后的弱毒疫苗，命名為AV41疫苗株，該疫苗免疫動物后免疫持續期能到1年左右，既能抵抗山羊痘病毒感染又能抵抗綿羊痘病毒感染。印度研制的經Vero細胞致弱的山羊痘病毒的活疫苗，接種102.5 TCID50的劑量，能提供4～6月齡的山羊52個月的保護［10］。肯尼亞綿羊山羊0240株是在自然條件下，同一個屬的病毒出現重組并分離得到的，此疫苗株能夠很好保護綿羊和山羊，在非洲的一些國家用于綿羊和山羊的接種免疫。但是弱毒疫苗存在免疫動物后毒力返強和散毒的風險，因此非常有必要研制出更加安全有效的疫苗。

3.3 多肽疫苗 綿羊痘病毒的VP3蛋白被證明是免疫性蛋白，并且在兔體內能引起高水平的體液免疫和細胞免疫［11］。用弗氏不完全佐劑乳化的VP3蛋白免疫羊可誘導產生1∶256滴度的血清抗體，對免疫 VP3后接種病毒21 d的羊提供67%的保護［12］。羊痘病毒的另一種結構蛋白－P32蛋白，是近些年的研究熱點，它有很好的免疫原性，能夠誘導中和抗體的產生，但是由于P32蛋白表達量低并且不穩定，這在一定程度上制約著此方法的應用前景。因此，找到另一種免疫原性更好，表達量、穩定性更好的基因勢在必行。

3.4 活載體疫苗 隨著分子技術的發展，以羊痘病毒作為活載體的研究取得了一些進展。羊痘病毒作為活載體有很多優點，其基因組結構明確，穩定性強，基因組容量大，可容納至少25 Kb的外源基因而不失去感染力，有多個復制非必需區，對外源基因的插入耐受性強。羊痘病毒宿主范圍窄，只感染羊，對其他動物安全性高，并且能引起強烈的細胞免疫。Romero等［13］構建的牛瘟病毒H基因的重組山羊痘病毒，動物試驗顯示，體內存在滴度較高的山羊痘病毒中和抗體和牛瘟病毒中和抗體。另外，Wade-Evans等［14］構建表達了藍舌病VP7基因的重組羊痘病毒。Aspdcn等［15］構建表達狂犬病病毒糖蛋白的重組羊痘病毒，作為復制缺陷型疫苗。Berhe等［16］構建表達小反芻獸疫病毒F基因的重組羊痘病毒都有很好的效果。

4 討論

目前我國研究羊痘病毒的實驗室已經研發出多個可以用于羊痘病毒診斷的分子和血清學診斷方法，但是各種原因，目前國內尚沒有商品化的診斷試劑盒問世，所以推動羊痘病毒診斷的標準化勢在必行。

隨著分子生物學的迅猛發展，目前對羊痘病毒基因的理解也更加深入。羊痘病毒毒力基因、宿主范圍基因和宿主之間的關系等基礎研究的深入，為研發新的檢測方法和疫苗提供了依據。另外，羊痘病毒作為活病毒載體有著眾多優點，研發羊痘病毒活載體為基礎的多價疫苗是今后一個重要的研究方向。

由于羊痘目前僅在亞洲和非洲發展中國家和落后國家大規模流行，歐洲早已消滅了羊痘病毒，因此發達國家對羊痘的研究較少。羊痘病毒的免疫和致病機制的研究幾乎是空白，因此，要加強和推動羊痘病毒的基礎研究，為羊痘的診斷、疫苗的研發和疾病的控制奠定基礎。

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S852.65+4

A

0529-6005(2017)06-0086-03

2016-07-19

國家重點研發計劃課題(2016YFD0500907);甘肅省國際科技合作專項(1604WKCA012);甘肅省國際科技合作專項(1504WKCA055)

李楊(1990-)，男，碩士生，研究方向為分子免疫與環境控制，E-mail:843290952@qq．com

顏新敏，E-mail:qzhang1616@sohu．com;張強，E-mail: qzhang1616@sohu．com