黃芩苷對原代大鼠肝細胞CYP3A1的影響

賈敬亮，陳有旺，張鵬程

(1．衡水市畜牧技術推廣站，河北 衡水 053000;2．廊坊職業技術學院動物科學與技術系，河北 廊坊 065000)

黃芩苷對原代大鼠肝細胞CYP3A1的影響

賈敬亮1，陳有旺2，張鵬程1

(1．衡水市畜牧技術推廣站，河北 衡水 053000;2．廊坊職業技術學院動物科學與技術系，河北 廊坊 065000)

膠原酶二步灌流法獲取原代大鼠肝細胞，用不同濃度的黃芩苷處理1～3 d，Western Blot法檢測細胞色素P450 3A1(CYP3A1)的表達。結果表明，通過膠原酶灌流法，每只大鼠可獲得2－4×108個肝細胞，存活率約為95%。低濃度(＜10μmol/L)的黃芩苷處理后，肝細胞CYP3A1的表達隨黃芩苷濃度的增加和處理時間的延長而呈升高的趨勢。高濃度(＞10μmol/L)黃芩苷對細胞產生毒性，原代大鼠肝細胞可用于黃芩苷藥物代謝的研究，為探討其他藥物的代謝打下了基礎。

黃芩苷;大鼠;原代肝細胞;CYP3A1

黃芩苷是傳統中藥黃芩的主要藥效成分，具有抗菌、抗氧化、清除自由基、抗炎、抗過敏、保護心血管、抗腫瘤、對腦損傷的修復保護、對糖尿病腎病的改善等藥理作用［1－2］，并對多種因素引起的肝臟損傷具用明顯的保護作用［3－5］。細胞色素P450 3A家族(CYP3A)是動物體內重要的Ⅰ相代謝酶，占肝臟中細胞色素P450酶(CYP)總量的25%～28%，約有60%的臨床藥物經肝臟CYP3A代謝［6］，在內源性和外源性物質的代謝中起著極其重要的作用。CYP3A1是大鼠CYP3A亞族最主要的亞型，它的活性高低直接影響許多藥物的治療效果和毒性反應。目前，黃芩苷對肝細胞CYP3A1有無誘導作用尚不清楚。

體外培養的原代大鼠肝細胞具有較好的體外試驗重現性，基本維持了肝臟的代謝功能，并能很好地保留與體內一致的CYP水平。本試驗采用膠原酶兩步灌流法分離大鼠肝細胞，并用黃芩苷作用肝細胞，通過測定其CYP3A1的表達，在細胞及分子水平上探討了黃芩苷藥物代謝的機理，為黃芩苷的臨床用藥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 成年SD雄性大鼠(清潔級)，體重(100～150)g，購自河北省實驗動物中心。

1.2 主要試劑 黃芩苷，購自中國藥品生物制品檢定所，William's E培養基(WME)、Hank's液、膠原酶Ⅰ、PCN(Pregnenolone-16α-Carbonitrile)，購自Sigma公司;胎牛血清，購自北京元亨圣馬生物技術研究所;Bradford蛋白定量試劑盒、預染蛋白 MarkerⅢ，購自北京天根生化科技有限公司;兔抗大鼠CYP3A1抗體，購自Chemicon公司;堿磷酶標記山羊抗兔IgG，購自北京中杉金橋生物技術有限公司; NBT、BCIP，購自Amresco公司。

1.3 肝細胞的分離和培養 膠原酶二步灌流法分離原代大鼠肝細胞，大鼠用速眠新麻醉后，打開腹腔，門靜脈插管，先灌入含0.5 mmol/L EGTA的無鈣Hank's液，漂洗大鼠肝臟2 min，再用0.04%膠原酶Ⅰ消化5 min，最后用Hank's液漂洗2 min后取出肝臟，分離肝細胞，肝細胞用WME培養基洗滌3次，1 000 r/min離心5 min，獲得純化的肝細胞懸液。將所得肝細胞懸液用0.4%的臺盼藍染色，檢測細胞活力并計數，用貼壁培養基調整細胞密度至3× 105cells/mL。接種于大鼠尾膠原處理的12孔板中，3×105/孔，37℃、5%CO2條件下，在WME中培養。24 h換液1次，并觀察肝細胞形態。

1.4 黃芩苷處理肝細胞 0.01～100μmol/L黃芩苷處理肝細胞1～3 d，10μmol/L PCN為陽性對照，蛋白裂解液收集蛋白，Bradford蛋白質定量試劑盒檢測蛋白濃度。

1.5 Western Blot法檢測CYP3A1的表達 蛋白變性，12%SDS-PAGE電泳，轉膜，5%脫脂奶封閉，加TBST 1∶4 000稀釋的CYP3A1一抗，TBST洗膜，加TBST 1∶2 000稀釋的堿磷酶標記IgG二抗，TBST洗膜，NBT/BCIP顯色，用ImageJ軟件計算所得條帶的灰度值。

2 結果

2.1 肝細胞的獲取 每只大鼠可獲得2～4×108個肝細胞，存活率在95%左右。

2.2 肝細胞的形態 倒置顯微鏡下觀察，新鮮分離的肝細胞呈圓球狀，單個散在;4 h后，大部分細胞貼壁生長并展開，連接成索狀;24 h后，貼壁的肝細胞呈典型上皮細胞樣的多角形形態，體積增大，細胞間開始出現島嶼狀連接(見中插彩版圖1);48 h后，肝細胞連接為成片島嶼狀;72 h后，肝細胞形態特征更加典型，單層生長呈板狀、條索狀(見中插彩版圖2)。

2.3 黃芩苷對CYP3A1表達的影響 黃芩苷作用24 h、48 h、72 h均對CYP3A1具有誘導作用。在作用24 h內，濃度低于0.5μmol/L的黃芩苷對肝細胞CYP3A1誘導作用不明顯，濃度增大到1μmol/L后，CYP3A1的表達隨藥物濃度的增加呈上升趨勢。作用48 h、72 h時，在黃芩苷濃度低于10μmol/L時，隨藥物濃度的增加和作用時間的延長，誘導作用增強，但濃度高于10μmol/L后，CYP3A1的表達明顯減弱(見中插彩版圖3)。

3 討論

3.1 原代大鼠肝細胞的分離培養 原代肝細胞的分離方法有機械法、螯合法和酶消化法等。早期的機械法對細胞損傷嚴重，獲取的肝細胞數量少，且功能活性低。螯合法是用能夠結合Ca2+、Mg2+的螯合劑來分離肝細胞，但分離細胞效果差。目前應用最廣泛的是膠原酶二步灌流法，因其在膠原酶消化細胞前使用了鰲合劑，對肝細胞損傷小，且分離徹底，是較好的肝細胞分離方法［7］。

本試驗應用膠原酶二步灌流法成功地獲得了活力強、形態完整的原代大鼠肝細胞。在分離過程中最關鍵的是膠原酶的用量和消化時間，膠原酶的濃度過高則作用時間難以控制，濃度過低則作用時間過長，細胞存活率低。在細胞培養中，選用合適的培養條件和培養基也非常重要。研究表明，正常肝細胞表面存在某些生長因子受體和激素受體，在培養液中加入合適的外源性生長因子和激素，共同發揮生物效應，對促進體外培養肝細胞的生長、分化、增殖及生物學功能的維持具有重要作用，不同類型的培養基對肝細胞的培養也有明顯的影響［8］。本文先用含有 10%胎牛血清及 10 mg/L ITS、100 nmol/L地塞米松的WME培養基中培養，待肝細胞貼壁后，換用不加血清的WME培養基培養，結果表明，肝細胞生長良好，并可長期培養用于試驗研究。

3.2 黃芩苷對肝細胞CYP3A1的影響 CYP是體內重要的藥物代謝酶，臨床和藥理研究表明，中草藥可對它產生誘導或抑制作用，從而引起自身和其他藥物的藥代動力學的變化，中藥的濃度、用藥時間、給藥方式等多種藥物因素均會影響其對CYP的作用［9］。黃芩苷是中藥黃芩的主要藥效成分，具有廣泛的藥理作用，且對肝臟損傷具有明顯的保護作用，侯艷寧等［10］，報道黃芩苷可誘導 CYP1A1、CYP2B1及CYP2C11等3種同功酶，另有研究表明，黃芩苷對大鼠肝微粒體CYP450酶7種亞型均無抑制作用，而對人肝微粒體 CYP1A2，CYP2C19和CYP2E1有較弱的抑制作用［11］。為確定黃芩苷對肝細胞CYP3A1的影響，本研究利用不同濃度的黃芩苷作用原代培養的大鼠肝細胞，并利用Western Blot法檢測了CYP3A1的表達。研究結果證實，黃芩苷對肝細胞CYP3A1確有誘導作用，且與藥物濃度和作用時間均有關。在短時間內低濃度黃芩苷不能夠誘導CYP3A1的表達，但隨著作用時間的延長和藥物濃度的增加，對CYP3A1的誘導作用會逐漸增強，而高濃度(＞10μmol/L)的黃芩苷隨作用時間延長，會對細胞產生毒性，致使部分細胞死亡，10μmol/L的黃芩苷是作用大鼠肝細胞72 h內的最佳用藥濃度。

［1］ 丁嬋，褚秀玲，蘇建青，等．黃芩苷抗病毒作用研究進展［J］．中獸醫醫藥雜志，2016，35(2):27-29．

［2］ 黃志軍．黃芩苷藥理作用研究進展［J］．天津藥學，2012，24 (3):61-64．

［3］ 章寶燕，林擁華，林志強．黃芩及其有效成分的肝臟保護作用研究進展［J］．中國中醫藥信息雜志，2014，21(12):129-133．

［4］ 高平章，陳金珍，李安娜，等．黃芩苷對對乙酰氨基酚誘導小鼠肝損傷中蛋白質氧化及硝化的影響［J］．華中科技大學學報，2015，44(1):64-68．

［5］ 劉嵩，呂曉慧，孫宗喜，等．黃芩苷抗氧化活性及對四氯化碳致大鼠肝損傷的保護作用［J］．中國藥學(英文版)，2015，24 (8):538-544．

［6］ Krippendorff B F，Lienau P，Reichel A，et al．Optimizing classification of drug-drug interaction potential for CYP450 isoenzyme inhibition assays in early drug discovery［J］．Journal of Biomolecular Screening，2007，12(1):92-99．

［7］ 徐哲，白雪帆，滕光菊，等．大鼠肝細胞分離、原代培養及生物學特性研究［J］．醫學研究生學報，2003，16(5):342-351．

［8］ Hamilton G A，Westmoreland C，George A E．Effects of medium composition on the morphology and function ofrathepatocytes cultured as spheroids and monolayers［J］．In Vitro Cellular Developmental Biology(Animal)，2001，37(10):656-667．

［9］ 王丹，張振清，阮金秀．中藥對細胞色素P450誘導或抑制作用的影響因素［J］．解放軍藥學學報，2008，24(3):242-244．

［10］ 侯艷寧，朱秀媛，程桂芳．黃芩甙對小鼠肝細胞色素P450及其亞家族的誘導［J］．解放軍藥學學報，2000，16(2):68-71．

［11］ 黃凱，劉志浩，賀晴．黃芩苷對大鼠和人肝微粒體CYP450酶的抑制作用［J］．中國實驗方劑學雜志，2016，22(3):20-23．

Effects of Baicalin on Cytochrome P450 3A1 in Rat Primary Cultured Hepatocytes

JIA Jing-liang1，CHEN You-wang2，ZHANG Peng-cheng1

(1．Hengshui Animal husbandry technology promotion station，Hengshui053000，China; 2．Animal Science and Technology Department，Langfang Polytechnic Institute，Langfang 065001，China)

Rat primary cultured hepatocytes were isolated by two-step collagenase digestion method and treated with gradient concentration of baicalin for 1－3 d，and the expression of cytochrome P450 3A1 was determined by Western Blot．The results showed that 2－4×108cells per rat were obtained and the viability was about95%．The expression of CYP3A1 in rat hepatocytes increased gradually with the treatment of low concentration baicalin(＜10 mol/L)，and high concentration(＞10 mol/L)baicalin injured hepatocytes．Rat primary cultured hepatocytes can be used for investigation of baicalin metabolism，and it also makes a foundation to explore other drugs metabolism．

baicalin;rat;primary cultured hepatocyte;CYP3A1

S853．7

A

0529-6005(2017)06-0037-02

2016-07-07

賈敬亮(1981-)，男，獸醫師，碩士，從事畜牧獸醫工作，E-mail:jiajingliang1981@163．com