氯離子通道蛋白-3對膠質瘤細胞增殖和侵襲的影響

張廣宇， 賈世峰， 曹旭華， 張曉煒， 焦保華

(1.河北醫科大學第二醫院 神經外科， 河北 石家莊 050000； 2.華北理工大學附屬醫院 腫瘤科， 河北 唐山 063000)

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氯離子通道蛋白-3對膠質瘤細胞增殖和侵襲的影響

張廣宇1， 賈世峰2， 曹旭華1， 張曉煒1， 焦保華1

(1.河北醫科大學第二醫院 神經外科， 河北 石家莊 050000； 2.華北理工大學附屬醫院 腫瘤科， 河北 唐山 063000)

目的： 觀察氯離子通道蛋白-3(ClC-3)對膠質瘤BT-235細胞增殖和侵襲的影響的子機制。方法： 采用siRNA技術構建ClC-3表達沉默的人膠質瘤BT-235細胞株，設為siClC-3組，并設置空白對照組和空載體組；采用Western bolting檢測3組細胞中ClC-3的表達，CCK8法檢測細胞增值活性，ranswell實驗用于測定細胞侵襲能力，通過測量細胞容積檢測細胞調控性容積下降率，流式細胞術用于測定細胞周期；采用Western bolting檢測cyclin D1、MMP-2和MMP-9的表達。結果： 相對于空白對照組，siClC-3組ClC-3表達明顯降低(P<0.01)，細胞增殖活性明顯降低(P<0.01)，細胞遷移率明顯降低(P<0.01)；空白對照組細胞調控性容積下降率為(79.35±2.31)%，而siClC組僅為(19.46±1.76)%，差異有統計學意義(P<0.01)；培養48 h的空白對照組BT-235細胞G0/G1期占比率為(57.2±3.1)%，而siClC-3組G0/G1期占比率提升至 (71.3±4.0)%，產生明顯的G0/G1期阻滯，差異有統計學意義(P<0.01)；相對于空白對照組，siClC-3組G1期調控蛋白cyclin D1、侵襲相關蛋白MMP-2和MMP-9表達水平明顯降低(P<0.01)。結論： ClC-3能明顯增強膠質瘤BT-235細胞增殖和侵襲能力，其作用機制與增加細胞調控性容積下降率，誘導cyclin D1、MMP-2和MMP-9表達有關。

氯離子通道蛋白-3； 神經膠質瘤； 增殖； 侵襲

膠質瘤是最常見的腦部惡性腫瘤，具有高度的異型性、較強的侵襲能力及對放化療抵抗的特點，是中樞神經系統致死率最高的惡性腫瘤，中位存活時間低于1.5年[1]。膠質瘤細胞過度增殖和廣泛的組織浸潤是膠質瘤治療困難的主要原因，尋找有效的阻斷膠質瘤細胞惡性增殖和侵襲的分子靶點是其研究的熱點[2]。氯離子通道蛋白3(chloride channel-3，ClC-3)是電壓依賴氯通道(chloridechannel of the CLCgene family，CLC)家族的一員，參與細胞調節性容量變化，與細胞增殖、分化、凋亡等細胞周期事件有密切的關系[3]。ClC-3在胸部腫瘤[4]、腦部腫瘤[5]和結直腸癌[6]等多種惡性腫瘤中呈現高表達，并且ClC-3在腦部腫瘤的高表達與其侵襲能力和惡性程度呈正相關關系，這種高表達的生物學意義和機制值得深入研究。本研究使用siRNA技術建立ClC-3表達敲除的腦膠質瘤細胞，擬探究ClC-3對腦膠質瘤細胞增殖和侵襲影響及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞及試劑

膠質瘤細胞株BT-325購自中科院上海細胞庫，由本室保存。胎牛血清和DMEM高糖培養基購自美國Gibco公司，胰蛋白酶、青霉素和鏈霉素購自美國Sigma公司，CCK-8(cell counting kit-8)試劑盒購自上海銘睿生物科技有限公司，siRNA引物和pLKO.1-Puro質粒購自南京建成生物技術有限公司，ClC-1和cyclin D1抗體購自南京凱基生物科技公司，MMP-2和MMP-9抗體購自北京索萊寶生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 分組 采用siRNA技術構建ClC-3表達沉默的人膠質瘤BT-235細胞株，設為siClC-3組，并設置空白對照組和空載體組。

1.2.2 膠質瘤BT-325 培養 膠質瘤BT-325細胞培養于25 cm2細胞培養瓶中,每瓶加5 mL 10%熱滅活的胎牛血清、25 mg/L-1青霉素和25.000 U/L鏈霉素的DMEM高糖培養基，在37 ℃、5% CO2和100%飽和濕度的CO2培養箱中培養。當細胞融合達到80%以上，胰蛋白酶消化傳代。

1.2.3 siRNA靶序列設計及細胞篩選 根據PubMed的GeneBank數據庫中ClC-3基因的序列以及siRNA的設計原則，設計人ClC-3 cDNA不同區域的RNAi，由Invitrogen公司設計合成，其序列為： 5′-AUAAUAGCUAACCUCCUCCAAACUA-3′，化學合成siClC-3克隆入pLKO.1-Puro質粒中，交由上海生工公司鑒定。預先培養于75 cm2細胞培養瓶中，待80%細胞融合時，經利用脂質體lipofectAMINE2000瞬時轉染膠質瘤細胞。轉染48 h后使用潮霉素篩選陽性克隆，陽性克隆即ClC-3基因表達沉默的BT-325細胞，并擴大培養。

1.2.4 CCK8法測定藥物敏感性 收集對數期BT-325細胞，以2×108/L密度接種于96孔板，經過上述技術路線處理方法處理后，按照操作說明，加入CCK8試劑10 μL,放置于5% CO2培養箱中孵育2 h，于酶聯免疫儀器上用波長450 nm處測定光密度值，OD值的大小反映活細胞的線粒體活性，細胞的線粒體活性=處理組的OD值/空白組的OD值×100%。

1.2.5 細胞容積測量 對數生長期的BT-325細胞用胰蛋白酶消化后，接種于含10%胎牛血清的DMEM培養基的24孔板中，置37 °C、5% CO2孵箱中培養3～4 h；置于等滲溶液中3 min，然后置于低滲液中25 min，最后重新回到等滲液中5 min；在倒置顯微鏡下連續拍照，每60 s/次，獲取的細胞圖像采用Imageproplus分析軟件進行分析，測量細胞容積方程：V = 4/3×S×(S/π)1/2，S指細胞面積，計算調控性細胞容積下降率[調控性細胞容積下降率(%)=Vmax-Vmin/Vmax-V0×100% ]。

1.2.6 流式細胞術觀察細胞周期 用PI染色區分細胞周期的變化。膠質瘤細胞，細胞消化后600 g離心5 min，冰冷PBS漂洗2次，離心后棄上清。用體積分數為70%冰乙醇制備成單細胞懸液，4 ℃固定24 h，PBS離心洗去乙醇加PI染液(含50 mg/L PI,10 mg/L RNAseA,0.1% TritonX-100,1%檸檬酸鈉和0.5% NaCl)，室溫下避光染色30 min，用EPICS XL型流式細胞儀收集20 000個細胞，記錄激發波長488 nm處紅色熒光強度，分析DNA周期，計算出細胞各期比例。

1.2.7 細胞侵襲實驗 用無血清培養基調細胞密度為2×108/L，在transwell小室(transwell chamber)上槽腔內加入100 μL無血清含0.2% BSA的2×104個膠質瘤細胞或者2×104個ClC-3敲除膠質瘤細胞，transwell小室下槽腔內加入600 μL含10% FBS的培養基，在37 ℃、5% CO2培養箱中培養12 h。用棉簽小心擦除transwell小室上槽腔內細胞，90%酒精固定30 min，0.1%結晶紫染色10 min，用PBS漂洗3次，每次10 min。倒置顯微鏡下隨機拍照，計算紫色細胞個數。

1.2.8 Western bloting檢測蛋白表達水平 取對數生長期3組細胞，收集蛋白樣品，加入等體積上樣緩沖液和10% DTT，95 ℃加熱變性5 min，8% SDS-PAGE電泳后，電轉移至PVDF膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h， 按照1∶1 000比例加入人ClC-3多克隆抗體及β-actin單克隆抗體，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌30 min，每10 min換液1次。分別加入1∶2 000稀釋辣根過氧化物酶標記的二級抗體，室溫孵育1 h(或37 ℃ 30 min)，TBST洗滌30 min，每10 min換液1次。在暗室中壓X片，完成結合信號顯影，凝膠成像系統分析實驗結果。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 siClC-3對膠質瘤BT-325細胞增殖的影響

Western bloting結果顯示，經siClC-3轉染后，BT-325細胞中ClC-3蛋白表達被明顯抑制，siClC-3組細胞ClC-3蛋白表達明顯低于空白對照組和空載體組(P<0.01)，見圖1。CCK-8法顯示，以空白對照組24 h細胞存活率為100%，經siClC-3轉染后，siClC組細胞24 h細胞存活率僅為5%,差異具有統計學意義(P<0.01)。

注：A為空白對照組，B為空載體組，C為siClC-3組圖1 siClC-3轉染對BT-325細胞中 ClC-3蛋白表達的影響Fig.1 Influence of siCIC-3 transfection on CIC-3 protein in BT-325 cell

2.2 siClC-3對膠質瘤BT-325細胞調控性容積的影響

細胞容積測量結果顯示，經siClC-3轉染后，siClC-3組細胞調控性容積下降率明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)，見表1。

表1 siDNA-PKcs對膠質瘤BT-325細胞 耐藥的逆轉作用±s)Tab.1 Conversing effect of siDNA-PKcs on glioma U251 cell resistance

(1)與空白對照組比較，P<0.05

2.3 siClC-3對膠質瘤BT-325細胞侵襲的影響

細胞侵襲結果顯示，經siClC-3轉染后，siClC-3組細胞遷移能力明顯低于對照組(P<0.01)，見圖2和表2。

2.4 siClC-3對膠質瘤BT-325細胞周期的影響

流式細胞術結果顯示，培養48 h的空白對照組BT-325細胞G0/G1期占比率為(57.2±3.1)%，S期細胞占比為(31.8±1.8)%，G2/M期細胞所占為(11.2±1.5)%；空載體組細胞G0/G1期占比率為(57.3±2.9)%，S期細胞占比為(31.5±2.1)%，G2/M期細胞所占為(l1.7±1.4)%，兩者間差異無統計學意義(P>0.05)。而siClC-3組G0/G1期占比率提升至 (71.3±4.0)%，S期細胞占比下降至(24.1±2.1)%，G2/M期細胞占比降低至(6.2±1.1)%，相對于空白對照組均差異有統計學意義(P<0.05)。這提示ClC-3蛋白表達沉默可使細胞周期停滯在G0/G1期。

注：A為空白對照組，B為空載體組，C為siClC-3組圖2 siClC-3轉染對BT-325細胞遷移能力的影響Fig.2 Influence of siCIC-3 transfection on BT-325 cell migration表2 siClC-3轉染對BT-325細胞 遷移能力的影響±s)Tab.2 Influence of siCIC-3 transfection on BT-325 cell migration

遷移細胞比率(%)空白對照組100±631空載體組9733±896siClC?3組1568±423(1)

(1)與空白對照組比較，P<0.05

2.5 siClC-3抑制膠質瘤BT-325細胞cyclin D1蛋白表達的影響

Western bloting檢測結果顯示，siClC-3轉染后，cyclin D1蛋白表達被明顯抑制，siClC-3組細胞ClC-3蛋白表達明顯低于空白對照組和空載體組(P<0.01)，見圖3。

注：A為空白對照組，B為空載體組，C為siClC-3組圖3 siClC-3轉染對BT-325細胞cyclin D1 蛋白表達的影響Fig.3 Influence of siCIC-3 transfection on BT-325 cell cyclin D1 protein expression

2.6 siClC-3對膠質瘤BT-325細胞遷移相關蛋白表達的影響

Western bloting檢測結果顯示，siClC-3轉染后，siClC-3組MMP-2和MMP-9蛋白表達被明顯抑制，明顯低于空白對照組和空載體組(P<0.01)，見圖4。

注：A為空白對照組，B為空載體組，C為siClC-3組圖4 siClC-3轉染對BT-325細胞遷移 相關蛋白表達的影響Fig.4 Influence of siCIC-3 transfection on BT-325 cell migration related protein expression

3 討論

膠質瘤是高度的異型性、侵襲能力和放化療抵抗較強的惡性腫瘤，迄今為止，其發病機制尚不明確，高增值和高轉移是其重要的特征。在腫瘤的轉移過程中，細胞形態變化是維持細胞進行遷移的物質基礎[7]。腫瘤細胞增殖則有賴于細胞是否進入分裂周期以及分裂周期能否完成，G1/S和G2/M轉換在其中發揮關鍵作用[8]。近年來研究人員發現，容積調節性氯通道參與調控細胞容積的變化，可能在細胞增殖中起重要作用；且其活性隨細胞周期進程改變而變化，當細胞靜止在G0期時活性較低，進入細胞周期G1后開始升高，G1/S轉換時其活性最高[9]。ClC-3是電壓依賴氯通道家族的一員，可表達在細胞膜上，從而可發揮氯離子通道功能，參與細胞調節性容量變化[10]。本研究通過siClC-3轉染敲除了腦膠質瘤細胞BT-325的ClC-3表達，發現ClC-3的表達沉默導致BT-325細胞調控性容積下降率的降低。ClC-3通過容積調節性氯通道參與調控細胞容積的變化，這表明ClC-3表達缺失導致BT-325細胞形變能力的缺失。而對細胞增殖和侵襲的研究發現，ClC-3的缺失導致BT-235細胞細胞增殖活性下降，并且細胞遷移能力同樣降低。

Ganapathi等[11]研究發現，當ClC-3高表達時，平滑肌細胞周期從G0/G1期向S期轉換加快，DNA合成增加；而siRNA沉默ClC-3則阻止細胞從G0/G1期進入S期，認為ClC-3參與與細胞周期G1/S轉換。在本研究中，ClC-3的缺失導致BT-235細胞阻滯于G0/G1期，提示ClC-3在膠質瘤細胞G1/S轉換發揮關鍵作用。對細胞周期相關蛋白的檢測發現，ClC-3的缺失導致cyclin D1表達下調。Cyclin D1是調控Gl期的重要的細胞周期蛋白，可以促進Gl/S期轉換而加速細胞周期過程，在包括膠質瘤在內的多種腫瘤中過表達[12]。Rohrbough等[13]的研究報道，鼻咽癌CNZ-2Z細胞中ClC-3的表達沉默抑制cyclin D1, cyclin E的表達，增加p27Kip1,p21Waf1表達。這些結果提示ClC-3蛋白可在信號通路較上游位置作為細胞周期促進因子調節細胞G1/S轉換。MMP-2 和 MMP-9，是基質金屬蛋白酶家族的成員，兩者可作為膠質瘤患者腫瘤轉移中的重要參與者。Larrouture等[14]研究報道，應用特異性抑制劑 IAA94 阻斷 ClC-1 通道可以抑制結腸癌細胞DLD-1的容積調節氯通道活性和氯通道電流，進一步western bloting分析顯示DLD-1細胞MMP-2 和 MMP-9表達下調。本研究對細胞遷移相關蛋白的檢測發現，ClC-3的表達缺失導致MMP-2 和 MMP-9表達下調，提示ClC-3對膠質瘤BT-235細胞的侵襲能力增強不僅涉及到細胞調控性容積下降率的增大，也與MMP-2 、MMP-9等侵襲相關蛋白上調相關。

綜上所述，本研究證實ClC-3通過調節細胞增殖而影響膠質瘤生長，為從氯通道角度為開發防治膠質瘤的藥物提供實驗依據；并且可為探索膠質瘤的防治提供一條新的思路，將有良好的臨床應用前景，對患者治療對策的制定和預后的判斷將起到積極的指導作用。

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(2016-09-12收稿，2016-11-26修回)

中文編輯： 劉 平； 英文編輯： 趙 毅

The Molecular Mechanism of ClC-3 in the Proliferation and Invasion of Malignant Glioma Cells

ZHANG Guangyu1, JIA Shifeng2, CAO Xuhua1, ZHANG Xiaowei1, JIAO Baohua1

(1.DepartmentofNeurology,SecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,Hebei,China; 2.DepartmentofOncology,AffiliatedHospitalofNorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,Hebei,China)

Objective: To observe the effects of ClC-3 on the proliferation and invasion of malignant glioma cells, and to explore its molecular mechanism. Methods: ClC-3 knockdown human gliomaBT-235 cell line was constructed by siRNA, and assigned as siCIC-3 group, blank control group and empty vector group were also established; Western blotting was used to detect the expressions of ClC-3; CCK8 method was used to detect the cell proliferation activity; transwell method was used to detect invasive ability; the measure of cell volume was used to detect the decrease of regulatory volume; flow cytometry was used to detected cell cycle; Western blotting was used to detect the expressions of cyclin D1, MMP-2 and MMP-9. Results: Compared with the blank control group, the expression of ClC-3 in siClC-3 group was significantly decreased (P<0.01), the cell proliferation activity was significantly decreased (P<0.01), the cell migration rate was decreased (P<0.01). The regulatory volume decrease rate in normal control group were (79.35±2.31)%, while in siClC-3 group were (19.46±1.76)%, the difference was statistically significant (P<0.01). The percentage of G0/G1 phase in the blank control group were (57.2±3.1)%, but siClC-3 group increased into (71.3±4.0)%, the difference was statistically significant (P<0.01). Compared with the blank control group, the expression of cyclin D1, MMP-2 and MMP-9 were significantly decreased in siClC-3group (P<0.01). Conclusion: ClC-3 could significantly enhance the proliferation and invasion of glioma BT-235 cells, and the underlying mechanism is related to the increasing of cell-regulated volume decrease rate and the up-regulation of cyclin D1, MMP-2 and MMP-9.

chloride channel-3; glioma; proliferation; invasion

時間：2016-12-15

http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1164.R.20161215.1534.018.html

R739.4

A

1000-2707(2016)12-1419-05

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.12.012