PCOS雌性模型大鼠血清、卵巢及腎上腺的雄激素水平*

王厚梅， 黃 林， 肖子文

(貴州醫科大學附院 婦產科， 貴州 貴陽 550004)

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PCOS雌性模型大鼠血清、卵巢及腎上腺的雄激素水平*

王厚梅， 黃 林， 肖子文**

(貴州醫科大學附院 婦產科， 貴州 貴陽 550004)

目的： 探討多囊卵巢綜合征 (PCOS)雌性SD模型大鼠血清、卵巢及腎上腺的雄激素水平。方法： 選取雌性SD大鼠，隨機分為對照組和實驗組,對照組以基礎飼料喂養，自由飲食飲水；實驗組進高脂高糖飲食，5%葡萄糖水，第1～42天給予諾和靈N(低精蛋白鋅胰島素NPH-Humulin)股內側皮下注射，第11～22天同時給予人絨毛膜促性腺激素皮下注射，6周處死大鼠；觀察大鼠卵巢組織學及卵巢重量，同時用酶聯免疫吸附法(ELISA)法測定血清黃體生成素(LH)、卵泡生成素(FSH)、睪酮(T)、游離睪酮(FT)、硫酸脫氫表雄酮(DHEA-S)，同時檢測卵巢組織及腎上腺組織勻漿T、FT、DHEA-S表達。結果： 實驗組大鼠卵巢組織鏡下見囊性擴張的卵泡增多，黃體及各種發育階段卵泡減少，對照組卵巢鏡下見多個黃體及不同發育階段的卵泡，卵泡內顆粒細胞呈多層，多為8～9層，造模成功;實驗組大鼠卵巢重量、血清T、LH、卵巢組織勻漿T均高于對照組，差異有顯著性(P<0.05);實驗組大鼠血清FSH、FT、DEAH-S與對照比較差異均無顯著性(P>0.05)；實驗組大鼠卵巢組織勻漿FT、DHEA-S及腎上腺組織勻漿T、FT、DEAH-S與對照比較差異均無顯著性(P>0.05)。結論: 多囊卵巢綜合征雌性SD大鼠模型的高雄激素血癥主要表現為高睪酮血癥，且卵巢所分泌睪酮影響高雄激素血癥發生可能性較大。

多囊卵巢綜合癥； 卵巢； 腎上腺； 血清； 大鼠，Sprague-Dawley ; 高雄激素癥

目前關于多囊卵巢綜合癥(PCOS)的概念已經超出了婦科內分泌的范疇，它集合了一組多樣的、多系統的慢性內分泌紊亂疾病，2003年制定了PCOS鹿特丹標準[1]：(1)稀發排卵，(2)高雄激素血癥或高雄激素臨床表現,(3)多囊性改變、一側或雙側卵巢直徑2～9 mm的卵泡≥12個、或卵巢體積≥10 mL；上述條件中符合任意2條，并排除其他高雄激素病因(高雄激素的臨床和生化表現是PCOS基本特征之一，但并不是所有患者同時具有高雄激素的臨床及生化表現，僅有70%～80%患者表現為高雄激素的生化表現[2])。本實驗通過建立多囊卵巢綜合征雌性SD大鼠模型檢測大鼠體內雄激素的分布，對多囊卵巢綜合征患者高雄激素來源進行探討，為更深認識PCOS提供更多的依據。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

清潔級雌性SD大鼠，體重180～220 g,8～9周齡。

1.2 方法

棉簽取大鼠陰道分泌涂片，電子顯微鏡觀察細胞變化，了解動情周期。選擇連續兩個以上規律動情周期的大鼠60只，按照編號隨機分為對照組n=15只與實驗組n=45只，每5只1籠；對照組3籠，實驗組9籠。對照組以基礎飼料喂養，自由飲食飲水；實驗組進高脂高糖飲食(基礎飼料 73%、豬油 10%、蔗糖15%、膽固醇2%)，給藥前喂普通飲用水，實驗期間喂5%葡萄糖水，第1～10天給予諾和靈N股內側皮下注射，每日1次，由0.5 IU遞增至5.0 IU，第11～22天持續5.0 IU劑量；同時第11～22天給予人絨毛膜促性腺激素皮下注射1.5 IU(溶于0.9%氯化鈉注射液0.2 mL)，每天 2次；22 天后對照組繼續普食喂養，實驗組繼續進高脂高糖飲食，持續至第6周。

1.3 觀察指標

1.3.1 體重 采用USA.HJ&HUAJIE稱重儀每周測定1次大鼠體重，稱重時間均為早上10點，并記錄。

1.3.2 卵巢重量及形態學觀察 6周后失血處死大鼠，立即解剖，雙側卵巢離體后采用USA.HJ&HUAJIE稱重，然后將一側卵巢組織浸泡于4%的甲醛中固定、切片、HE染色、組織學觀察。

1.3.3 血清促卵泡素(FSH)、黃體生成素(LH)、睪酮(T)、游離睪酮(FT)、硫酸脫氫表雄酮(DHEA-S)測定 處死前采大鼠股靜脈血液5 mL，室溫血液自然凝固10～20 min，離心20 min左右(3 000 r/min)，收集上清液，采用上海基爾頓公司提供的大鼠酶聯免疫分析(ELISA)試劑盒測定血清LH、FSH、T、FT、DHEA-S。

1.3.4 卵巢組織勻漿T、FT、DHEA-S測定 處死大鼠后迅速解剖離體雙側卵巢組織，手工將一側卵巢組織充分勻漿，用上海基爾頓公司提供的大鼠酶聯免疫分析(ELISA)試劑盒測定卵巢組織勻漿中T、FT、DHEA-S。

1.3.5 腎上腺組織勻漿T、FT、DHEA-S測定 方法同卵巢組織勻漿。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 卵巢重量及形態學觀察

兩組大鼠6周后處死，實驗組30例，雙側卵巢重量(0.113±0.224)g，對照組10例，雙側卵巢重量(0.096±0.108)g，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)。對照組卵巢肉眼觀察表面色澤紅潤，模型組外觀蒼白，體積增大，可見較多囊狀擴張卵泡。模型組卵巢見囊性擴張的卵泡增多，黃體及各種發育階段卵泡減少，其卵泡內卵母細胞或放射冠消失，顆粒細胞層數減少至2～3層(圖1A)。對照組卵巢鏡下見多個黃體及不同發育階段的卵泡，卵泡內顆粒細胞呈多層，多為8～9層(圖1B)。

圖1 兩組大鼠卵巢組織染色(HE，100×)Fig.1 HE staining of ovarian tissue of rats in the two groups

2.2 血清FSH、LH、T、FT、DHEA-S

實驗組大鼠血清LH、T值水平高于對照組，P<0.05，實驗組FSH、FT、DHEA-S值與對照組相比，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組大鼠血清LH、FSH、T、 FTDHEA-S水平Tab.1 The serum hormone levels of two groups

(1)兩組比較P<0.05

2.3 卵巢及腎上腺組織勻漿T、FT、DHEA-S

實驗組卵巢組織勻漿T水平較對照組升高，差異有統計學意義；實驗組卵巢組織勻漿FT、DEAH-S及腎上腺組織勻漿T、FT、DHEA-S水平比較差異無統計學意義，P>0.05。見表2。

表2 兩組大鼠卵巢和腎上腺組織T、 FT、DHEA-S水平Tab.2 The hormone level of two groups' ovarian and adrenal tissue

(1)與對照組比較,P<0.05

3 討論

目前多囊卵巢綜合征病因不清，由于臨床表現的復雜性和高度異質性，故病因學一直是研究的熱點與難點,關于PCOS病因主要涉及5個方面：(1)GnRH分泌控制異常；(2)卵巢原發障礙；(3)高雄激素分泌；(4)胰島素抵抗；(5)肥胖因素。GnRH的高頻率脈沖可導致LH分泌增加，FSH增加不明顯，卵巢局部形成高LH的環境，卵泡發育障礙，卵泡閉鎖增加。在卵巢原發障礙中，卵巢卵泡膜細胞表面某些酶表達異常導致雄激素合成增加，因雄激素增多與胰島素抵抗兩者緊密相連，形成雄激素-胰島素-雄激素的自我延續的“惡性循環”。而對于生化性多囊卵巢綜合征患者體內的高雄激素代謝如何，臨床上有不同看法。在女性體內雄激素主要有雄烯二酮(A2)、睪酮(T)、脫氫表雄酮(DHEA)、硫酸脫氫表雄酮(DHEA-S)以及雙氫睪酮(DHT)，正常生理下這些雄激素主要來源于卵巢卵泡膜細胞產物及腎上腺皮質醇合成的中間產物，故有學者認為高雄激素癥主要由卵巢引起，而有人認為由腎上腺引起，還有學者認為由外周脂肪組織引起。

本實驗中實驗組SD大鼠病理可見,卵巢外觀體體積增大，白膜增厚，可見較多囊狀擴張卵泡，鏡下見卵巢間質不同程度增生，顆粒細胞減少，無優勢卵泡形成，與PCOS卵巢病理改變相似。對照組大鼠卵巢組織切片見正常結構卵泡，有優勢卵泡形成。通過ELISA檢查方法檢測顯示實驗組PCOS雌性SD大鼠血液循環中LH、T及卵巢組織勻漿中T水平均出現了明顯升高，而血清FSH、FT、DHEA-S,卵巢組織勻漿的FT、DHEA-S及腎上腺組織勻漿的T、FT、DHEA-S與對照組相比升高不明顯，差異無統計學意義。LH與FSH協同促進卵泡發育，激發排卵，促進顆粒細胞黃素化;當LH高峰出現促進顆粒細胞分化，同時也抑制顆粒細胞的有絲分裂和增殖，使顆粒細胞過早進入分化狀態，導致顆粒細胞增殖終止，最終導致卵泡發育停止在竇卵泡階段，無優勢卵泡形成。另者因FSH和LH結構相似，兩者有競爭性，當LH水平升高時，FSH維持在相當于或低于卵泡早期水平，故在PCOS患者中其FSH水平大多都正常或稍微偏低[3]。有學者通過原位雜交方法發現,雄激素受體(AR) mRNA主要在大鼠卵泡膜細胞表達明顯，卵巢AR與雄激素結合在卵泡發育局部控制機制上的重要作用[4]，主要表現在調控卵泡發育的早期階段，例如應用抗雄激素抗體可以阻止小鼠的竇前卵泡發展到排卵前卵泡[5]。卵泡膜細胞體外細胞培養實驗表示多囊卵巢綜合征患者體內合成雄激素過程的酶活性都增強[6]，如P450側鏈裂解酶、17-α羥化酶(CYP17),生成大量雄激素最終導致高雄激素環境使大量卵泡閉鎖。本實驗中PCOS雌性SD大鼠卵巢局部高雄激素水平影響了早期卵泡發育，增加卵泡數量及大小，同時促使卵泡閉鎖，發生不排卵，腎上腺所分泌睪酮與高睪酮血癥發生可能無明顯關系。眾多學者研究發現約50%患者存在不同程度的胰島素抵抗及代償性高胰島素血癥，胰島素受體可增強LH釋放并促進卵巢分娩雄激素，又可抑制性激素結合蛋白(SHGB)的合成[7]，減少與睪酮的結合致游離T濃度升高。但是游離睪酮濃度在體內含量較低，很多因素可以影響它與SHBG的親和力，包括年齡、肥胖、妊娠、雄激素治療和多囊卵巢綜合征，導致總睪酮與游離睪酮部分錯配，故對于游離睪酮的測定存在誤差可能。硫酸脫氫表雄酮只源于腎上腺，DHEA-S是腎上腺功能標志性檢測物，且DHEA-S分泌的增加應該考慮到年齡與種族的關系，DHEA-S會隨著年齡增加而減少。有研究表示高劑量外源性睪酮對做過卵巢切除術婦女的影響，發現切除卵巢后，DHEA-S增加不明顯[8]。張焰等研究結果顯示在PCOS組DHEA-S與對照組中差異無統計學意義[9]。另有研究表示高胰島素對腎上腺合成的脫氫表雄酮(DHEA)抑制作用[10]。最近有研究提出伴或不伴有高雄激素血癥的多囊卵巢綜合征患者，其DHEA-S水平無明顯變化[11]。本實驗結果顯示其卵巢組織中DHEA-S含量應該比腎上腺組織含量少，但其兩者均值相比較，卵巢含量稍高，這與實驗對象的生理性質有關。

綜上所述，PCOS雌性SD大鼠血液循環中出現高LH及高T水平，其體內雄激素主要分布在血液中及卵巢中，卵巢卵泡膜細胞與間質細胞分泌過多的雄激素通過血液循環進入體內，產生高雄激素血癥，進而出現一系列的臨床表現。對于卵泡膜細胞及間質細胞產生高雄激素水平機制及腎上腺分泌的雄激素有沒有其他因素間接導致高雄激素血癥有待進一步研究。

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(2016-09-27收稿，2016-11-09修回)

中文編輯： 劉 平； 英文編輯： 趙 毅

Androgen Levels in Female SD Rats with Polycystic Ovarian Syndrome

WANG Houmei, HUANG Lin, XIAO Ziwen

(DepartmentofObstetricsandGynecology,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

Objective: To investigate the androgen levels in serum, ovary and adrenal gland in PCOS SD rats. Methods： Female SD rats were randomly divided into control group and test group. The control group was fed with the basic diet food and uncontrolled water; test group was fed with high-fat and high-sugar diet, 5% glucose water, and on 1 to 42 days was given Novolin N (low protamine zinc insulin NPH-Humulin), vastus medialis subcutaneous injection, while on 11 to 22 days was injected with human chorionic gonadotropin, then killed the rats. Observing weight of ovaries and ovarian tissue pathological，then the serum levels of luteinizing hormone(LH), follicle stimulating hormone(FSH), testosterone(T), free-testosterone(FT), dehydroepiandr-Osteronesulfate (DHEA-S) was observed by using ELISA, meanwhile T, FT, DHEA-S levels in ovarian tissue and adrenal tissue were tested. Results: Microscopically, the test group showed the large follicular cystic increased, corpus luteum and follicles at various developmental stage decreased. While the control group showed many corpus luteum and follicles at each development stage, granulosa cells lined with 8-9 layers. These showed the models built successfully. The weight of ovaries, the serum T level, the serum LH level and the ovarian tissue T level of test group were higher than the control group (P<0.05). The results of the serum FSH, FT, DEAH-S comparison between the two groups had no significant difference (P>0.05). The ovarian FT, DHEA-S and the adrenal T, FT, DEAH-S had no significant difference between the test group and the control group (P>0.05); Conclusion: High level serum testosterone is the mainly manifestation of hyperandrogenism, the ovary maybe the major organ to secret it.

polycystic ovary syndrome; ovary; adrenal gland; serum; rats,Sprague-Dawley; hyperandrogenism

貴州省科技廳攻關課題SY[(2011)3021號]

時間：2016-12-15

http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1164.R.20161215.1534.019.html

R711.75

A

1000-2707(2016)12-1415-04

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.12.011

**通信作者 E-mail:19763368@qq.com