三種復方中藥對亞慢性氟中毒大鼠脂質過氧化物清除能力的影響*

柳 青, 袁筑華, 申惠鵬, 黃朝暉, 王 丹, 成錦芳, 黃德遠, 喻茂娟**

(1.貴州醫科大學， 貴州 貴陽 550004; 2.遵義醫藥高等專科學校, 貴州 遵義 563002; 3.貴州省疾病預防控制中心， 貴州 貴陽 550004; 4.北京市通州區永樂店鎮衛生院， 北京 101105; 5.貴陽市第一人民醫院, 貴州 貴陽 550002)

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·基礎研究·

三種復方中藥對亞慢性氟中毒大鼠脂質過氧化物清除能力的影響*

柳 青1, 袁筑華1, 申惠鵬2, 黃朝暉1, 王 丹3, 成錦芳4, 黃德遠5, 喻茂娟1**

(1.貴州醫科大學， 貴州 貴陽 550004; 2.遵義醫藥高等?？茖W校, 貴州 遵義 563002; 3.貴州省疾病預防控制中心， 貴州 貴陽 550004; 4.北京市通州區永樂店鎮衛生院， 北京 101105; 5.貴陽市第一人民醫院, 貴州 貴陽 550002)

目的： 比較3種中藥方劑對亞慢性氟中毒大鼠脂質過氧化物的清除能力，探討中藥復方制劑治療慢性氟中毒的機制。方法： 224只SD大鼠分為正常對照組、中氟組、高氟組和高氟低蛋白低鈣組，后3組大鼠給予相應含氟飼料或低蛋白低鈣飼料喂養制作亞慢性氟中毒大鼠模型；造模180后，中氟組、高氟組及高氟低蛋白低鈣組大鼠又分為模型組、甲方劑組、乙方劑組和丙方劑組，后3組大鼠給于相應中藥方劑治療90 d；觀察各組大鼠實驗過程中的體重增長、氟斑牙情況，并與中藥治療90 d時取肝臟和腎臟制作組織勻漿檢測過氧化氫酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量。結果： 各模型組組織勻漿CAT含量均高于正常對照組(P<0.05)；在給予丙方劑治療后，各個治療系列中肝/腎組織勻漿CAT含量都有所降低(P<0.05)，說明丙方劑對降低CAT水平有作用，即能提高脂質過氧化物的清除能力；各模型組腎臟組織勻漿MDA含量高于正常對照組(P<0.05)；給予甲方劑和乙方劑治療后，肝/腎組織勻漿MDA含量有所降低,說明甲方劑和乙方劑對降低MDA水平有作用，即能提高脂質過氧化物的清除能力，其中乙方劑較甲方劑效果更好。結論： 丙方劑能調節CAT含量的能力，使其能恢復到清除H2O2的正常范圍；甲方劑和乙方劑可抑制MDA含量升高，其中乙方劑最好。

中草藥； 氟中毒，牙； 大鼠,Sprague-Dawley； 脂質過氧化作用

氟中毒在世界范圍內都有流行，中國的某些地區是地氟病重度流行地區。氟中毒對全身各系統都有損害，高氟引起機體自由基水平增高是氟中毒時各系統損傷機制中的關鍵環節。正常情況下，自由基的產生和清除處于一個平衡的代謝狀態，然而某些情況下產生過多的活性氧，則自由基就會攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸(PUFA)引起一系列氧化過程，即脂質過氧化(lipid peroxidation，LP)。氟元素可刺激多形核白細胞(PMN)發生呼吸爆發，消耗氧氣，釋放超氧陰離子自由基(·O2)和一氧化氮(NO)，造成脂質過氧化物堆積，因此可通過脂質氧化物的清除能力來評價中藥復方制劑對氟中毒的治療效果。脂質過氧化中間產物為丙二醛(MDA)，測定血清(或血漿)、肝臟及腎臟組織中的MDA都可以反映體內脂質過氧化程度。機體中的過氧化物酶系是清除這些過氧化物的酶，其中過氧化氫酶(CAT)所占比例最大，占過氧化物酶系的40%，但是高水平的CAT可以催化H2O2和Cl-生成氧化能力更強的次氯酸，因此過高的CAT表明機體過氧化物的增加，肝臟及腎臟組織中CAT水平可作為間接評價機體內脂質過氧化物水平的參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要試劑與藥品 氟化鈉(NaF，分析純，成都市聯合化工試劑研究所)，中藥甲方劑的主要成分有黃芪、當歸、海風藤、金錢草等，乙方劑的主要成分有杜仲、山茱萸、螃蟹、土鱉等，丙方劑的主要成分有杜仲、枸杞、黨參、茯苓、金錢草等，均由遵義醫藥高等?？茖W校生產，CAT和MDA試劑盒由南京建成生物工程研究所生產。

1.1.2 主要儀器 PXJ-1B型數字式離子儀(江蘇江分電分析儀器廠)，CJJ-781型磁力攪拌器(江蘇金壇市環保儀器廠)，232型參比電極、PF-1型負離子選擇電極(上海精密科學儀器有限公司)，MQX200超級酶標儀(BIO-TEKINSTRUMENTS.INC)，Costar 3590型酶標板(上海源葉生物科技有限公司)。

1.1.3 實驗動物 選用斷乳兩周的純系Wistar大鼠224只，平均體質量(91.1±10.3)g，由貴州醫科大學實驗動物中心提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組及制作氟中毒大鼠模型 造模前大鼠適應性喂養1周(動物室相對濕度50%～60%)后，隨機將224只大鼠分為4組，正常對照組8只，中氟組、高氟組、高氟低蛋白低鈣組各72只，后3組分別食用不同氟含量的食物，自由飲用自來水，每周觀察大鼠生長發育狀況及牙齒變化情況以判斷大鼠是否出現亞慢性氟中毒。氟中毒模型大鼠自由食用NaF飼料，參照文獻[1-2]制作氟中毒大鼠模型，高氟組染氟劑量為100 mg/kg，中氟組染氟劑量為50 mg/kg，高氟低蛋白低鈣組染氟劑量與高氟組相同、但飼料中蛋白含量及鈣含量減半(高氟組飼料)。將氟加入飼料中：每千克飼料中加入NaF 110.5 mg，飼料中氟含量即為50 mg/kg；每千克飼料中加入NaF 221.1 mg，氟含量即為100 mg/kg。

1.2.2 治療 染毒180 d后開始中藥治療，甲方劑大鼠每天的劑量為1.94 mg/g，乙方劑為3.51 mg/g，丙方劑為3.62 mg/g。中藥干粉用蒸餾水配制成混懸液，每天按1 mL/100 g 經口灌服，每周灌服6 d，連續灌服90 d。中藥治療階段動物分組：正常對照組8只，中氟組、高氟組及高氟低蛋白低鈣組再分為1個非治療組18只和3個中藥方劑治療組各18只分別灌服3種中藥。

1.2.3 觀察指標 觀察實驗過程中各組大鼠的進食量、體重增長情況、牙齒等一般情況，造模及治療270 d時處死大鼠，取肝及腎臟，稱重后生理鹽水沖洗，按1∶9加入預冷生理鹽水，分別制成組織勻漿，3 500 r/min離心10 min，取上清1.5 mL，4 ℃保存備用。用比色法[3]檢測CAT，硫代巴比妥酸熒光法[4]檢測MDA。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 大鼠生長發育狀態

實驗期間，大鼠一般狀態良好，各模型組進食量較對照組減少。染毒階段前4月，各實驗組的體重增長均較對照組緩慢，其中高氟低蛋白低鈣組的體重增長比對照組、中氟組和高氟組都慢，差異有統計學意義(P<0.05)；染氟前4月，各組大鼠每月的體重都比上月增長，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 染氟期各組大鼠體質量變化±s)Tab.1 Weight of rats during the exposure period

(1)與同組前1個月比較,P<0.05;(2)與高氟低蛋白低鈣組比較,P<0.05

2.2 氟斑牙

染氟1個月左右，高氟組大鼠開始出現輕度氟斑牙，釉質表面出現黃白相間條紋改變；染氟期末，除正常對照組外，其它各組均出現程度不同的氟斑牙，且隨染氟劑量升高，氟斑牙損傷明顯加重，甚至下齒尖部可見明顯的磨損；各模型組氟斑牙發生率均高于正常對照組，高氟低蛋白低鈣組氟斑牙發生率比中氟組高，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 染氟期各組大鼠氟斑牙情況Tab.2 Dental fluorosis results of the exposure period

(1)與對照組比較P<0.05，(2)與中氟組比較P<0.05

2.3 肝臟和腎臟組織中CAT含量

肝臟及腎臟組織勻漿的CAT含量作為肝臟和腎臟的清除脂質過氧化物的指標之一。肝臟清除脂質過氧化物指標: 各模型組肝臟組織勻漿CAT含量均高于正常對照組(45.22±5.99)U/g，差異有統計學意義(P<0.05)。中氟治療系列和高氟治療系列各組大鼠肝臟CAT水平，只有丙方劑組大鼠CAT水平低于模型組(P<0.05)。高氟低蛋白低鈣治療系列中，乙方劑組和丙方劑組CAT低于高氟低蛋白低鈣模型組，差異有統計學意義(P<0.05)，腎臟清除脂質過氧化物指標：各模型組腎臟組織勻漿CAT含量均高于正常對照組(42.11±14.83)U/g有統計學意義(P<0.05)。中氟治療系列和高氟治療系列各組大鼠腎臟CAT水平，只有丙方劑組大鼠CAT水平低于模型組(P<0.05)。高氟低蛋白低鈣治療系列中，乙方劑組和丙方劑組CAT低于高氟低蛋白低鈣模型組有統計學意義(P<0.05)，見表3。

治療后肝腎組織勻漿CAT含量的變化提示丙方劑有降低CAT含量，提高清除脂質過氧化物的能力。在各方劑之間，各組丙方劑肝臟/腎臟CAT活性均低于甲方劑和乙方劑，差異有統計學意義(P<0.05)，丙方劑降低CAT活性方面好于其他兩個方劑(見表3)。

表3 各組大鼠肝臟CAT活性Tab.3 CAT assay in liver results of the rats between the drug groups

(1)與未治療比較，P<0.05；(2)與甲方劑比較，P<0.05；(3)與乙方劑比較，P<0.05

2.4 肝臟和腎臟組織勻漿MDA含量

肝臟及腎臟組織勻漿的MDA含量作為肝臟和腎臟的清除脂質過氧化物的指標之一。肝臟清除脂質過氧化物能力指標：各模型組肝臟組織勻漿MDA含量均高于正常對照組(15.46±2.31)μmol/L,差異有統計學意義(P<0.05)。高氟治療系列和高氟低蛋白低鈣治療系列中，甲方劑組和乙方劑組肝臟MDA含量均低于高氟模型組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表4。腎臟清除脂質過氧化物能力指標：各模型組腎臟組織勻漿MDA含量均高于正常對照組(48.72±11.70)μmol/L，差異有統計學意義(P<0.05)。高氟治療系列和高氟低蛋白低鈣治療系列中，甲方劑組和乙方劑組MDA含量均低于高氟低蛋白低鈣模型組有統計學意義(P<0.05)，見表4。

治療后肝腎組織勻漿MDA含量的變化提示甲方劑和乙方劑均有降低MDA含量，提高清除脂質過氧化物的能力。各方劑之間，高氟低蛋白低鈣治療系列乙方劑肝臟MDA含量低于甲方劑，差異有統計學意義(P<0.05)；高氟和高氟低蛋白低鈣治療系列中乙方劑腎臟MDA含量低于甲方劑，差異有統計學意義(P<0.05)。提示乙方劑在清除脂質過氧化產物方面效果好于甲方劑，見表4。

表4 各組大鼠肝臟和腎臟MDA活性測定結果Tab.4 MDA assay in liver results of the rats among the drug groups

(1)與未治療比較，P<0.05；(2)與甲方劑比較，P<0.05；(3)與乙方劑比較，P<0.05

3 討論

本次實驗以NaF飼料飼養Wistar大鼠270 d，實驗觀察發現，大鼠在染氟后出現了不同程度的活動減少，體重增長緩慢等現象。慢性氟中毒對動物最為顯著的影響是氟斑牙，因此氟斑牙常常作為判斷建立氟中毒模型成功與否以及防治氟中毒效果的可靠指標之一。實驗結果顯示，各模型組出現了不同程度的氟斑牙，且正常對照組并未出現氟斑牙，提示已成功地復制出了亞慢性氟中毒大鼠模型。亞慢性氟中毒大鼠的肝腎CAT、MDA含量均高于正常對照組大鼠，提示亞慢性氟中毒大鼠體內脂質過氧化物水平確實發生了改變。在復方中藥治療亞慢性氟中毒效果上，丙方劑降低CAT活性方面好于其他兩個方劑，甲方劑、乙方劑在清除MDA方面都有較好的效果，其中乙方劑更好。根據預實驗發現，在染毒90 d后，高氟染氟組開始出現氟斑牙，提示90 d開始出現氟中毒癥狀，持續染毒180 d后，再對成功建立的亞慢性氟中毒大鼠進行中藥治療。在治療90 d后，各組清除脂質過氧化物的相關指標(CAT含量、MDA含量)趨于穩定。

CAT是一種酶類清除劑，又稱為觸酶，以肝臟中含量最多，但在細胞中過氧化氫酶多存在于微體，胞漿和線粒體中卻很少。CAT以鐵卟啉為輔基，一分子中含有4個鐵原子[5]，形成血紅素的活性位點，并處于高度自旋的Fe3+狀態，可促使H2O2分解為分子氧和水，清除體內的H2O2，從而使細胞免于遭受H2O2的損害。CAT雖不是脂質過氧化產物，但可催化H2O2和Cl-形成一種強烈的氧化劑和氯化劑，即次氯酸，其活力強于H2O2100倍[6]。所以較低的CAT活力對減輕機體組織氧化和細胞損傷有著積極的作用。有研究發現，氟中毒非干預組髓過氧化物酶(MPO)酶活力均顯著高于干預組和對照組[7]。CAT是過氧化物酶體的標志酶，約占過氧化物酶體酶總量的40%，研究過氧化物酶可間接反映CAT含量。另外，Fe參與過氧化氫酶、過氧化物酶的合成，同時也是人體造血所必須的主要微量元素，并與乙酰輔酶A、琥珀酸脫氫酶、細胞色素還原酶的活性密切相關[8]。如今，對氟中毒狀態下體內Fe含量的變化說法不一。氟雖然不能直接影響鐵的代謝，卻會導致細胞內脂質過氧化作用增強，細胞受到損傷，而損傷的細胞內Fe、Cu、Zn含量和比值發生了改變，使Fe、Cu含量增加[9]。有研究表明，活性鐵是脂質過氧化的催化劑，鐵與巰基結合有很強的催化作用，在鐵離子催化下可產生活性很強的自由基(·OH)和其他氧化劑，提示鐵過載的病理變化與自由基形成有關[10]。氟中毒高鐵狀況，勢必會提高CAT活性，引發脂質過氧化反應的增強。丙方劑可能調節體內微量元素間的比例，使鐵含量恢復正常，從而降低CAT活性。

MDA是脂質過氧化過程中中間產物，可交聯蛋白質和磷脂的氨基，影響膜流動性，使膜脆性增加，其含量的變化可間接的反應組織中氧自由基含量的變化。甲方劑、乙方劑提高抗氧化力的同時還可減少脂質過氧化物含量。

綜上所述，中藥復方的作用機制可減少脂質過氧化物的產生，或清除其中間產物，對減輕氟中毒的高氟狀態有一定作用。

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(2016-09-06收稿，2016-11-16修回)

中文編輯： 劉 平； 英文編輯： 趙 毅

A Study on Chinese Medicine Formula Enhancing Elimination Lipids Peroxide Capacity of Chronic Fluorosis Rats

LIU Qing1, YUAN Zhuhua1, SHEN Huipeng2, HUANG Zhaohui1, WANG Dan3,CHENG Jinfang4, HUANG Deyuan5, YU Maojuan1

(1.GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.ZunyiMedicalandPharmaceuticalCollege,Zunyi563002,Guizhou,China; 3.GuizhouCenterforDiseaseControlandPrevention,Guiyang550004,Guizhou,China;4.HealthCenterofTongzhouDistrictYongleTowninBeijingCity,Beijing101105,China;5.TheFirstPeople'sHospitalofGuiyang,Guiyang550002,Guizhou,China)

Objective: To explore the effect of three Chinese medicine formulae which may enhance ability of eliminating lipid peroxide of chronic fluorosis rats, and discuss relevant mechanism. Methods: 224 rats were divided into 4 groups: control group, medium-dose fluorine group, high-dose fluorine group, high-dose fluorine supplemented with low protein and low calcium diet group. The latter three groups were fed with fluorine containing feed or low protein low calcium feed, in order to produce sub chronic fluorosis rats; after model producing for 180 days, the latter three groups were further divided into model group, prescription A group, prescription B group and prescription C group. These three new groups were treated with traditional Chinese Medicine formula for 90 days; observing weight gain and dental fluorosis condition, and make tissue homogenate to test CAT activity and MDA content with liver and kidney after 90days of treatment. Results: Compared with control group, the CAT of positive control group was increased which was statistically significant (P<0.05). After given treatment of prescription C, CAT in both liver and kidney had been decreased implying prescription C is effective for decreasing the level of CAT, which enhanced ability of eliminating lipids peroxide. Compared with control group, the MDA content of model groups were higher than that of control group(P<0.05). After given treatment of prescription A and B, MDA in both liver and kidney had been decreased implying prescription A and B are effective for decreasing the level of MDA, which enhanced ability of eliminating lipids peroxide, meanwhile prescription B is more effective than prescription A. Conclusion: Prescriptions C are able to adjust the content of CAT, and make it back to the normal range to eliminate H2O2. Prescription A and prescription B are able to restrain the content of MDA, prescription B is more effective.

drug,Chinese herbal; fluorosis,dental; rats,Sprague-Dawley; lipid peroxidation

國家自然科學基金(81560511)

時間：2016-12-15

http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1164.R.20161215.1534.016.html

R285.5; R5999.9

A

1000-2707(2016)12-1393-05

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.12.006

**通信作者 E-mail:maojuanyu@gmc.edu.cn