β-淀粉樣肽對大鼠原代海馬神經細胞中SIRTs表達的影響*

董陽婷， 譚龍春， 官志忠,**

(1.貴州醫科大學附院 病理科， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫科大學 地方病與少數民族性疾病教育部重點實驗室， 貴州 貴陽 550004)

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β-淀粉樣肽對大鼠原代海馬神經細胞中SIRTs表達的影響*

董陽婷1， 譚龍春2， 官志忠1,2**

(1.貴州醫科大學附院 病理科， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫科大學 地方病與少數民族性疾病教育部重點實驗室， 貴州 貴陽 550004)

目的： 探討β-淀粉樣蛋白(Aβ)對原代培養海馬神經細胞中沉默信息調節因子( SIRTs)表達的影響。方法： 分離出生24 h內SD乳鼠大腦海馬區域，培養原代神經細胞，CCK-8試驗觀察0、0.1、0.2、0.5、1.0、1.5及2.0 μmol/L Aβ寡聚體(AβOs)對細胞增殖的影響，選取恰當濃度的AβOs進行后續實驗；將實驗分為對照組(Control)和Aβ組，Aβ組給AβOs 處理24 h后，運用Western blotting方法及Realtime PCR方法檢測SIRT1、SIRT3、SIRT4及SIRT5的蛋白及mRNA表達水平。結果： CCK-8結果顯示，0.5 μmol/L AβOs作用于大鼠原代海馬神經細胞24 h時細胞存活率明顯低于對照組(P<0.05)，且不影響細胞的存活率；0.5 μmol/L AβOs處理大鼠原代海馬神經細胞24 h后，與Control相比，SIRT1、SIRT3、SIRT4及SIRT5蛋白及mRNA表達水平均不同程度降低(P<0.05或0.01)。結論： AβOs可使海馬神經細胞中SIRTs 蛋白及mRNA表達水平降低，這可能與AD病人發病后學習記憶能力減退有關。

阿爾茨海默?。?β-淀粉樣肽1-42； 海馬神經元； 沉默信息調節因子

阿爾茨海默病(alzheimer’s disease, AD)，又稱原發性老年癡呆癥，是一種主要在老年期發生的神經元退行性變性疾病，以進行性癡呆為主要特征，包括記憶力衰退、認知功能障礙、失語、性格和行為改變等，該病首先由德國的精神病醫生Alois Alzheimer[1-2]于1907年發現，并以他的名字命名。AD的主要病理改變是相關腦區出現以β-淀粉樣肽(β-amyloid peptide，Aβ)沉積形成的老年斑(senile plaques，SPs)、高度磷酸化Tau蛋白聚集形成的神經元纖維纏結(neurofibrillary tangles，NITs)及神經元丟失[3]，研究還發現AD的發病機制與β-淀粉樣肽沉積、脂質代謝、線粒體老化、氧化應激、凋亡及突觸功能有著密切關系[4-6]。沉默信息調節因子(silent information regulators, SIRTs)是具有去乙酰化作用的蛋白，其激活依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)，研究表明哺乳動物SIRTs可與p53、FOXO、PGC-1α、NF-κB、Ku70等蛋白相互作用調控細胞應激反應、代謝衰老和凋亡等過程，尤其是在神經退行性疾病中扮演了重要角色。本研究用AβOs處理原代海馬神經元細胞，建立類AD細胞模型，觀察AβOs對神經元中SIRTs的作用，探討AD發病中學習記憶能力減退的相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑

實驗動物為24 h內新生SD (Sprague Dawley)乳鼠14只，體重5～10 g(由貴州醫科大學動物實驗中心提供)，本研究獲得貴州醫科大學倫理委員會批準(編號1311018)。主要試劑有多聚賴氨酸、Aβ1-42、六氟異丙醇購自Sigma公司(美國),Neurobasal-A 培養基、Hibernate-A培養基、B-27添加劑、GlutaMAX添加劑購自Gibco公司(美國),青霉素及鏈霉素購自Hyclone公司(美國),BCA蛋白定量試劑盒購自Thermo公司(美國), CCK-8試劑盒購自Dojindo公司(日本),鼠抗SIRT1抗體購自Abcam公司(英國),兔抗SIRT3抗體購自Santa Cruz公司(美國),兔抗SIRT4抗體購自Gene Tex公司(美國),鼠抗SIRT5抗體購自Santa Cruz公司(美國)；兔抗β-actin(Abmart,上海),辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗兔、抗鼠二抗均購自Cell Signaling公司(美國),Trizol 試劑(美國Invitrogen公司)；逆轉錄試劑盒(美國 Fermentas Life Sciences公司),SYBR Green染料試劑盒(美國 Roche Diagnostics公司)。

1.2 方法

1.2.1 體外制備AβOs 參照文獻[7-10]在體外制備AβOs的方法，將Aβ1-42粉末中加入充分預冷的HFIP，使其終濃度為1 mmol/L。瓶口保持封閉，室溫孵育60 min后，冰上靜置10 min，分裝成5管，開蓋通風過夜，使HFIP完全揮發后，-80 ℃冰箱保存。使用時于冰上加入DMSO充分溶解，終濃度為5 mmol/L，再用不含酚紅的F12培養基稀釋，4℃孵育24 h后，14 000 g，4 ℃離心10 min，備用。

1.2.2 大鼠原代海馬神經細胞的培養 大鼠原代海馬神經細胞培養參考文獻[7]并適當改進。取新生SD乳鼠，75%酒精浸泡5 min，無菌條件下取出大腦，放入預冷的D-Hank’s平衡鹽液中，迅速去除腦膜及血管。海馬以0.25% 胰蛋白酶37 ℃消化15 min，中間振搖3次，用含10%胎牛血清的DMEM-F12種植培養基終止消化，吸出種植培養基，加入含2% B27的Neurobasal培養基，輕輕吹打20次，靜置2 min，輕輕吸取上層細胞懸液，用含2% B27的Neurobasal培養基稀釋成單細胞懸液,以1×109個/L密度接種在經左旋賴氨酸(PLL)鋪被過的6孔板內，于37 ℃，相對體積分數為0.05的CO2培養箱中進行培養，每隔3 d以Neurobasal-A/B27培養基半量換液。

1.2.3 細胞毒性實驗 采用CCK-8法，原代海馬神經細胞以1×108個/L濃度接種于96孔板中，分別以0、0.1、0.2、0.5、1.0、1.5及2.0 μmol/L的AβOs處理細胞，每個濃度設5個復孔，每孔加100 μL細胞懸液，培養至24 h后，將每孔原始培養基取出，置換為不含B27及藥物的純培養基100 μL，空白對照組加入100 μL無細胞純培養基，于每孔中加入10μL CCK-8試劑，37 ℃孵育2 h，450 nm波長測定吸光度。

1.2.4 AβOs處理細胞 大鼠原代海馬神經細胞培養至第7～10 天，形態完整時，用不含B27的純培養基培養2 h，加入0.5 μmol/L AβOs處理24 h后收集細胞，強效裂解液提取細胞總蛋白，BCA法進行蛋白定量。

1.2.5 SIRT1、SIRT3～5蛋白表達水平 用5×蛋白上樣緩沖液及去離子水按照樣品濃度稀釋樣品，95 ℃加熱變性5 min，然后進行電泳。轉膜、封閉后，分別用SIRT1及SIRT 3～5抗體(濃度分別為1∶1 000、1∶500、1∶1 000及1∶300)與轉蛋白膜4 ℃孵育過夜，再與辣根過氧化物酶聯結的抗兔或抗鼠IgG(濃度為1∶5 000)室溫孵育1 h。將膜與ECL-plus試劑反應，顯影膠片曝光，沖洗膠片后用圖像分析儀處理。

1.2.6 SIRT、SIRT 3～5 mRNA表達水平 采用標準Trizol-酚-氯仿一步法提取總RNA，設計SIRT1及SIRT 3～5和β-actin引物，引物序列見表1。將mRNA逆轉錄反應生成cDNA，以逆轉錄產物為模板進行Real-time PCR。SDS 1.4軟件分析其ΔCt、2-ΔCt值及RQ(relative quantity)值，RQ=2-ΔΔCt。分析實驗結果以β-actin為內對照，計算各種基因的相對表達水平。

表1 SIRTs及β-actin基因引物序列Tab.1 Primer sequences of SIRTs gene and β-actin

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 AβOs細胞毒性試驗

CCK-8試驗結果顯示，0.5 μmol/L AβOs作用于大鼠原代海馬神經細胞24 h時細胞存活率明顯低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，且不影響細胞的存活率，故選擇0.5 μmol/L Aβ1-42處理細胞進行以下研究。見圖1。

(1)與Control組比較，P<0.01圖1 不同濃度AβOs對大鼠原代海馬神經 細胞存活率的影響Fig.1 The effect of different concentrations of AβOs on survival rate of primary rat hippocampal neurons

2.2 SIRT1及SIRT 3～5蛋白表達水平

與Control組相比，0.5 μmol/L AβOs處理大鼠原代海馬神經細胞24 h后，SIRT1及SIRT3-5蛋白相對表達水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖2。

2.3 SIRT1及SIRT 3～5 mRNA表達水平

與Control組相比，0.5 μmol/L AβOs處理大鼠原代海馬神經細胞24 h后，SIRT1及SIRT3～5mRNA相對表達水平明顯升高(P<0.05或P<0.01)，見圖3。

3 討論

SIRTs是一組激活依賴于NAD+的具有去乙酰化作用的蛋白；研究表明，哺乳動物SIRTs可與p53、FOXO、PGC-1α、NF-κB、Ku70等蛋白相互作用調控著細胞應激反應、代謝衰老和凋亡等過程，尤其是在神經退行性疾病，如AD中扮演了重要角色。目前人類SIRTs家族中公認的成員有7個，分別是SIRT1～SIRT7。目前研究最多的是SIRT1，其參與眾多神經損傷及神經退行性疾病的神經保護作用[12-13]，尤其是在AD中具有復雜、多方面的神經保護作用[14-16]，其與記憶的形成和維持與突觸可塑性、DNA甲基化、組蛋白尾的翻譯后修飾、非編碼RNA等機制有關，以小鼠作為模型，特異性敲除腦內SIRT1的小鼠出現認知及記憶障礙，表明SIRT1在維持神經可塑性方面發揮重要作用；突觸核蛋白(synuclein)是一種突觸前膜蛋白，其α亞型已被證實與帕金森病等多種神經退行性疾病有關，而且使用白藜蘆醇處理后可以對抗α-Synuclein的毒性[17-18]。研究發現，Tg2576小鼠大腦的初級神

注：(1)與Control組比較， P<0.01圖2 大鼠原代海馬神經細胞中SIRT1、SIRT3、SIRT4及SIRT5蛋白表達水平Fig.2 The protein expression of SIRT1, SIRT3, SIRT4 and SIRT5 in primary rat hippocampal neurons after treated with AβOs

注：與Control組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01圖3 大鼠原代海馬神經細胞中SIRT1、SIRT3、SIRT4及SIRT5 mRNA表達水平Fig.3 The mRNA expression of SIRT1, SIRT3, SIRT4 and SIRT5 in primary rat hippocampal neurons after treated with AβOs

經元中過表達SIRT1基因，可減少Aβ的分泌，引起sAPPα水平升高，減少Rho激酶1(rho-activated kinase 1，ROCK1)的表達[16]，而通過抑制他汀類藥物刺激sAPPα生成激活ROCK1，可以減少SIRT1介導的一些反應[19]。

另外，AD認知功能下降與年齡相關的神經元結構及功能改變有關，如突觸功能障礙[20]，而突觸活動又強烈依賴于線粒體提供足夠ATP的功能[21]。SIRT 3～5存在于線粒體基質中，可調節其多種代謝酶的乙?；饔?，在賴氨酸乙?；牡鞍踪|組學研究中發現，超過20%的線粒體蛋白被乙?；@項研究證明SIRTs(主要是SIRT1及SIRT3) 去乙?；饔迷诰S持線粒體功能中起到重要的調節作用[22]。最近一項研究得出結論，AD患者大腦SIRT3表達降低，SIRT3在很大程度上通過抗氧化系統的靶向調節減少ROS的產生[23-24]；下調SIRT3可能破壞線粒體的能量代謝及合成，最終促進AD的病理變化[25]。另外兩個存在于線粒體內的成員，包括SIRT4及SIRT5，其在AD發病機制中的作用并不十分清楚。

本研究發現，SIRT1及SIRT 3～5蛋白及mRNA的表達在加入AβOs的原代海馬神經元中均出現不同程度的降低。已有研究表明，SIRT3表達的程度與SIRT1的表達是平行的，SIRT1表達的降低可以直接影響SIRT3的表達[26]；當SIRT1表達減少同時引起SIRT3表達減少，進一步抑制電子傳遞鏈(electron transfer chain, ETC)蛋白的線粒體復合物I活化，從而減少NAD+的生成，ROS產生增加，并抑制ATP生成，導致神經元死亡；另外，SIRT4表達減少可引起谷氨酸產生增多，導致神經元損傷[27-28]；而沒有足夠的SIRT5發揮去乙?；饔?，引起細胞色素C在線粒體中的蓄積，進而導致線粒體膜間隙調節氧化代謝功能紊亂及細胞凋亡的發生[29]，最終促進AD的病理變化。

綜上所述，SIRTs家族對神經系統具有一定保護作用，其可以通過不同途徑影響神經退行性疾病的進展，現階段除了SIRT1及SIRT2研究較多以外，SIRT3-SIRT7在該類疾病中的作用尚不十分明確，弄清楚SIRTs家族在AD發病機制中所扮演的角色，對AD的防治起著關鍵性作用。

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(2016-10-15收稿，2016-12-03修回)

中文編輯： 劉 平； 英文編輯： 周 凌

Effect of β-amyloid Peptide on SIRTs Expression in Rat Primary Hippocampal Neurons

DONG Yangting1, TAN Longchun2, GUAN Zhizhong1,2

(1.DepartmentofPathology,AffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China;2.TheKeyLaboratoryofEndemicandEthnicDiseasesinMinistryofEducationofP.R.China,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

Objective: To investigate the effect of β-amyloid peptide (Aβ) on expressions of silent information regulators (SIRTs) in rat primary hippocampal neurons. Methods: Rat primary neurons were prepared and cultured from the brain hippocampus of newborn (within 24 h) SD rats. Cell Counting Kit-8 (CCK-8) was employed to detect the effect of 0, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 1.5 and 2.0 μmol/L Aβ oligomers (AβOs) on proliferation of neurons．The appropriate concentration of AβOs was selected for subsequent experiments. Rat primary hippocampal neurons were divided into control group and Aβ group which was treated with Aβ for 24 h. The protein and mRNA expressions of SIRT1, SIRT3, SIRT4 and SIRT5 were detected by Western blotting and real-time PCR. Results: According to CCK-8 results, 0.5 μmol/L AβOs was selected for subsequent experiments. The protein and mRNA expression of SIRT1, SIRT3, SIRT4 and SIRT5 were significantly attenuated when the cells treated with 0.5 μmol/L AβOs for 24 h. Conclusions: AβOs can reduce the levels of protein and mRNA of SIRTs in rat primary hippocampal neurons, which might be a mechanism of cognitive deficit of AD．

Alzheimer's disease; β-amyloid peptide1-42; hippocampal neurons; silent information regulators

國家自然科學基金(81260173)； 教育部“長江學者和創新團隊發展計劃資助”(IRT13058)； 貴州省科技計劃[黔科合重大專項字(2014)6008號]； 貴州省創新計劃項目[黔教合協同創新中心(2014)06]

時間：2016-12-15

http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1164.R.20161215.1534.027.html

R749.1； R34-33

A

1000-2707(2016)12-1376-06

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.12.003

**通信作者 E-mail:1457658298@qq.com