洛伐他汀對抗人神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞β-淀粉樣蛋白的非膽固醇依賴性保護作用*

趙 亮， 官志忠

(1.貴州醫科大學 微生物學教研室， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州醫科大學附院 病理科, 貴州 貴陽 550004； 3.貴州醫科大學 地方病與少數民族性疾病教育部重點實驗室， 貴州 貴陽 550004； 4.貴州省醫學分子生物學重點實驗室 貴州醫科大學， 貴州 貴陽 550004)

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洛伐他汀對抗人神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞β-淀粉樣蛋白的非膽固醇依賴性保護作用*

趙 亮1,2， 官志忠2,3,4**

(1.貴州醫科大學 微生物學教研室， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州醫科大學附院 病理科, 貴州 貴陽 550004； 3.貴州醫科大學 地方病與少數民族性疾病教育部重點實驗室， 貴州 貴陽 550004； 4.貴州省醫學分子生物學重點實驗室 貴州醫科大學， 貴州 貴陽 550004)

目的： 觀察洛伐他汀對過表達APP670/671的人神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞活性及β-淀粉樣蛋白(Aβ)二聚體合成的影響。方法： 轉染并鑒定過表達APP670/671的SH-SY5Y細胞，篩選無細胞毒性、不影響細胞膽固醇水平濃度的洛伐他汀處理SH-SY5Y細胞24 h，采用CCK-8試驗檢測細胞的存活率，蛋白印跡法檢測Aβ二聚體的蛋白表達水平。結果： 過表達APP670/671的SH-SY5Y細胞中APP的蛋白及mRNA表達水平均明顯高于野生型細胞；用 0.1 μmol/L的洛伐他汀處理SH-SY5Y細胞，未見明顯細胞毒性作用，膽固醇水平亦未見明顯改變；0.1 μmol/L洛伐他汀預處理 SH-SY5Y細胞24 h，能提高細胞存活率，減少Aβ二聚體的分泌。結論： 洛伐他汀具有神經保護作用，可能與減少毒性Aβ的合成有關。

洛伐他汀； β-淀粉樣蛋白； 淀粉樣前體蛋白； 阿爾茲海默病

阿爾茲海默病(alzheimer’s disease，AD)是一種神經退行性疾病，是老年人最常見的癡呆病因[1-2]。近來的研究發現，β-淀粉樣蛋白(β-Amyloid peptide，Aβ)單體以及構成老年斑的Aβ纖絲體都不是造成神經毒性的主要Aβ形式，而可溶性寡聚Aβ是產生神經毒性的主要Aβ形式。有研究證實人和轉基因小鼠的大腦組織中至少可以產生4種可以改變神經元和認知功能的可溶性Aβ寡聚體分子：二聚體、三聚體、Aβ*56和環狀原纖維，對神經元突觸產生不同的毒性作用[3]。目前，對于AD的預防和治療仍缺乏有效的措施。他汀類藥物能通過抑制β-羥-β-甲戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMG-CoA reductase)的活性并減少內源性膽固醇的合成，常用于治療伴有膽固醇增高的心血管疾病[4]。越來越多的研究顯示，他汀類還具有多種生物學效應，對多種神經退行性疾病，例如AD、帕金森氏病、多發性硬化癥、腦缺血等，具有潛在的治療作用[5]。他汀類藥物在神經退行性疾病中的作用，是直接與其降膽固醇效應相關、還是有賴于非降膽固醇依賴性的其他多重效應，目前尚未完全明確。本實驗將洛伐他汀(Lovastatin)作用于過表達Swedish 670/671變異APP基因的人神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞(SH-SY5Y/APPSWE細胞)，了解洛伐他汀非膽固醇依賴性抗毒性Aβ的神經保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

SH-SY5Y細胞獲贈于瑞典卡洛琳斯卡大學。主要試劑：洛伐他汀、膽固醇定量試劑盒、Aβ1-42(美國Sigma公司)；細胞計數試劑盒(日本Dojindo公司)； SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒(碧云天生物技術公司)；BCA蛋白定量試劑盒，cDNA合成試劑盒，TRIzol試劑(美國Thermo公司)；NuPAGE Novex 4%～12% Bis-Tris預制膠、MES SDS電泳液(美國Life Technologies公司)；SYBR green master和X-treme GENE 9 DNA轉染試劑(瑞典Roche公司)，PVDF膜、ECL試劑盒(德國Merck Millipore公司)。小鼠抗Aβ多克隆抗體6E10(美國Covance公司)，兔抗β-actin抗體(Abmart公司)，抗兔IgG(美國Cell Signaling公司)，抗小鼠IgG(美國Santa Cruze公司)。pcDNA 3.0質粒及攜帶Swedish 670/671變異APP基因的pcDNA 3.0質粒獲贈于瑞典卡洛琳斯卡大學。

1.2 方法

1.2.1 SH-SY5Y細胞培養及APP(Swedish 670/671)基因轉染 參考文獻[6]中的方法，將SH-SY5Y細胞接種于DMEM高糖型培養基(含10%胎牛血清、青霉素100 000 U/L和鏈霉素100 000 U/L)，培養至細胞生長達到80%～90%，按照X-tremeGENE 9 DNA轉染試劑說明進行操作，將空載pcDNA 3.0質粒或攜帶Swedish 670/671變異位點APP基因的pcDNA 3.0質粒轉染至SH-SY5Y細胞中，培養72 h后收集轉染細胞，以上轉染細胞制備每次3份，重復3次。

1.2.2 轉染APP(Swedish 670/671)基因的細胞鑒定 (1)APP mRNA表達水平檢測，根據APP670/671基因設計并合成擴增引物，上游序列為AAGAAGAAACAGTACACATCCATTCATC，下游序列為TGGATTTTCGTAGCCGTTCTG，產物大小為235 bp；β-actin引物購自ABI公司，序列號為4352935E，收集SH-SY5Y WT細胞(僅含pcDNA3.0質粒)和SH-SY5Y/APPSWE細胞(含攜帶human APP670/671 pcDNA3.0質粒)，用TRIzol法提取細胞mRNA，轉錄成cDNA，以β-actin為內參，用ABI PRISM 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems，美國)進行Real-time PCR反應，檢測APP670/671基因的mRNA表達。(2)APP蛋白表達水平檢測，收集SH-SY5Y WT細胞和SH-SY5Y/APPSWE細胞，用含有蛋白酶抑制劑苯甲基硫酰氟(PMSF)的裂解液裂解，提取細胞總蛋白，DC蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。選取4%～12%的Bis-Tris預制梯度膠，將等量蛋白與含還原劑的上樣緩沖劑混合后，70 ℃加熱10 min，加入預制膠的孔中電泳，120 V穩壓轉移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，封閉2 h，小鼠抗Aβ 6E10抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，辣根過氧化酶標記的抗小鼠IgG二抗孵育1 h，用ECL發光試劑觀察表達情況。

1.2.3 洛伐他汀處理細胞及指標檢測 取鑒定后的SH-SY5Y/APPSWE細胞接種培養24 h后，細胞生長達80%～90%時，去血清培養12 h，加入洛伐他汀(0.01、0.1及1 μmol/L)分別處理24 h，檢測細胞毒性及膽固醇水平。為檢測洛伐他汀抗A(的神經保護作用，將SH-SY5Y WT細胞和SH-SY5Y/APPSWE細胞分別以相同的濃度(1×109個/L)接種培養，細胞生長至80%～90%，加入洛伐他汀培養24 h后進行檢測如下檢測。(1)細胞毒性試驗，采用CCK-8法檢測細胞毒性。取SH-SY5Y細胞以1×104個/孔濃度接種于96孔板中，每個濃度藥物處理的細胞設5個復孔，培養至計劃時間后，將每孔的原始培養基取出并加入不含血清及藥物的純培養基100 μL，空白對照組加入100 μL無細胞純培養基，然后每孔中加入CCK-8試劑10 μL ，37 ℃孵育2 h，450 nm波長測定吸光度[7]。(2)膽固醇水平檢測，膽固醇濃度測定按照膽固醇定量試劑盒說明進行操作。去除培養基，PBS洗3次后，每孔加入氯仿∶異丙醇∶IGEPAL CA-630(7∶11∶0.1)溶液200 μL，裂解細胞后14 000 g離心10 min，取上層有機相于新管中，50 ℃溫箱中空氣干燥，真空抽吸30 min，干燥脂質用Cholesterol Assay Buffer進行溶解，震蕩混勻，按試劑盒說明加入試劑和樣品，同時應用膽固醇標準品繪制標準曲線，按50 μL/孔將反應混合物加入96孔板，混勻后37 ℃避光孵育1 h，570 nm波長處測量吸光度值。計算膽固醇濃度(C)：C=Sa/Sv，[Sa為根據標準曲線計算的樣品膽固醇含量(μg)，Sv為每孔加樣體積(μL)]。(3)蛋白印跡法檢測Aβ水平，收集細胞培養基，15 000 g冷凍離心15 min，用western blotting方法(見1.2.2)檢測培養基中Aβ蛋白表達水平。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 SH-SY5Y/APPSWE細胞鑒定

轉染APP(Swedish 670/671)基因的SH-SY5Y細胞，APP蛋白表達量較對照組轉染空載pcDNA3質粒的細胞明顯增高(P<0.01)，見圖1A。SH-SY5Y/APPSWE細胞APP mRNA表達量較對照組轉染空載pcDNA3質粒的細胞明顯增高(P<0.01)，見圖1B。

注：A為APP mRNA表達；B為APP蛋白表達；(1)與Con組比較，P<0.01圖1 SH-SY5Y/APPSWE細胞APP mRNA 及蛋白表達水平Fig.1 The mRNA and protein levels of APP in the SH-SY5Y/APPSWE cells

2.2 洛伐他汀細胞毒性試驗

CCK-8試驗結果顯示(圖2)，1 μmol/L洛伐他汀作用24 h，可見SH-SY5Y/APPSWE細胞存活率分別下降50%，與未加藥組(Con)相比，具有顯著差異(P<0.01)，所以在后面的研究中，選擇0.01和0.1 μmol/L濃度的洛伐他汀。

注：(1)與Con組比較， P<0.01圖2 洛伐他汀細胞毒性試驗Fig.2 Cytotoxicity of lovastatin in the SH-SY5Y/APPSWE cells

2.3 洛伐他汀對膽固醇水平的影響

0.01、0.1、1 μmol/L洛伐他汀處理神經細胞24 h，可見1 μmol/L洛伐他汀使神經細胞膽固醇水平明顯下降(圖3)，與對照組相比，具有統計學意義(P<0.05)。

注：(1)與Con組比較， P<0.05圖3 洛伐他汀對SH-SY5Y/APPSWE細胞膽固醇水平的影響Fig.3 Effect of lovastatin on cell cholesterol level in the SH-SY5Y/APPSWE cells

2.4 洛伐他汀對SH-SY5Y/APPSWE細胞活性的影響

CCK-8試驗結果顯示， SH-SY5Y/APPSWE細胞去血清培養48 h，細胞存活率較SH-SY5Y/WT細胞顯著降低(43%)，具有統計學意義(P<0.01)。在培養基中加入0.1 μmol/L洛伐他汀可提高SH-SY5Y/APPSWE細胞的存活率，與對照組相比，具有統計學意義(P<0.05)，見圖4。

注：WT為SH-SY5Y/WT細胞，APPSWE為SH-SY5Y/APPSWE細胞，Lov為洛伐他汀；(1)與[WT]組比較，P<0.05;(2)與[APPSWE]組比較，P<0.05圖4 SH-SY5Y/APPSWE細胞洛伐他汀抗 Aβ細胞活性試驗Fig.4 Experiment of anti-Aβ by lovastatin in SH-SY5Y/APPSWE and SH-SY5Y/WT cells

2.5 洛伐他汀對Aβ二聚體蛋白水平的影響

去血清培養細胞48 h，可見SH-SY5Y/APPSWE細胞與SH-SY5Y/WT細胞比較，Aβ二聚體蛋白水平明顯升高(P<0.05)；而在培養基中加入0.1 μmol/L洛伐他汀共同培養，可降低SH-SY5Y/APPSWE細胞產生的Aβ二聚體蛋白水平(圖5)，與未用洛伐他汀處理的SH-SY5Y/APPSWE細胞比較，差異具有統計學意義(P<0.05)。

注：WT為SH-SY5Y/WT細胞，APPSWE為SH-SY5Y/APPSWE細胞，Lov為洛伐他汀；(1)與[WT]組比較，P<0.05;(2)與[APPSWE]組比較，P<0.05圖5 SH-SY5Y/APPSWE細胞Aβ二聚體蛋白水平Fig.5 The protein level of Aβ dimer in SH-SY5Y/ APPSWE and SH-SY5Y/WT cells

3 討論

隨著AD發病率的不斷增高，給病人、家庭乃至整個社會帶來了越來越沉重的負擔，據世界衛生組織統計，全球AD患者共有3 600萬，預計至2030年，該數值將翻倍，至2050年，AD患者將達到1億[8]。為了應對這種日漸嚴峻的狀況，急需尋找有效的干擾措施來阻止或推遲AD的發病、延緩AD病程、改善AD癥狀，然而自2004年來，并沒有新的抗AD藥物得到上市的批準[9]。“老藥新用”的方法已經成為眾多抗AD藥物開發的首選[10]。

近期的研究報道顯示他汀類藥物的應用能降低61%的AD死亡率[11]。除了降膽固醇作用以外，他汀類藥物還能產生多種膽固醇非依賴性作用，影響多個重要的生理過程，例如，調節內皮細胞功能、抗炎癥反應、抗氧化應激、影響細胞增殖及調節Aβ代謝、tau蛋白代謝等[12-15]，產生抗癡呆效應。然而，也有研究得出不同的結論。多個臨床隨機試驗顯示他汀類藥物對于AD的治療沒有效果[16]。有研究顯示statins類藥物治療(無論是親脂性還是低親脂性)并不能影響65歲以上老人AD及其他癡呆發生的危險性，甚至還有可能加重AD的病情[17]。有人推測可能與膽固醇的合成減少有關，導致以上不同結果的相關作用機制尚不清楚。

本實驗通過細胞模型，研究洛伐他汀抗Aβ神經毒性損害的非膽固醇依賴性神經保護作用。結果顯示，洛伐他汀作用濃度低于1 μmol/L(0.01 μmol/L和0.1 μmol/L)，對SH-SY5Y/APPSWE細胞基本沒有毒性；同時，不會引起細胞膽固醇水平下降。所以，本實驗選擇了0.1 μmol/L的洛伐他汀建立非膽固醇依賴性神經細胞模型。

大量研究表明，Aβ是AD的重要致病因子之一。其異常代謝是引起Aβ堆積，老年斑形成等毒性作用的主要原因[1]。研究顯示，Aβ不僅以單體和纖維狀聚合體形式存在，還可以二、三和四聚體等寡聚體形式存在[3]。最初認為老年斑中僅僅是不可溶的纖維狀Aβ有神經毒性作用，然而隨后的研究發現APP轉基因小鼠的認知功能異常、神經元及突觸功能和結構改變出現在淀粉樣斑塊形成之前[18-19]。并且大量研究結果均提示，多種Aβ1-42寡聚體與非神經元及神經元細胞膜上的多種成分，包括脂類、離子通道、受體等相結合引起一系列復雜的突觸、神經元和神經元網絡功能及結構的異常，導致學習、記憶等行為異常[20-22]。有研究顯示來源于AD病人大腦的Aβ二聚體具有毒性作用，可以直接損傷突觸可塑性及記憶功能[23]。

在本實驗中發現，過表達APP的SH-SY5Y/APPSWE細胞去血清培養48 h，與未過表達APP(Sweden 670/671)的SH-SY5Y/WT細胞比較，可觀察到細胞存活率顯著降低(P<0.01)，同時，SH-SY5Y/APPSWE細胞Aβ二聚體的蛋白表達水平明顯高于SH-SY5Y/WT細胞；有趣的是，預先用0.1 μmol/L洛伐他汀處理細胞，可觀察到由于APP過表達產生的過多內源性Aβ誘導的細胞毒性作用被減弱，與Aβ毒性作用組比較，細胞存活率顯著上升(P<0.05)，細胞Aβ二聚體表達水平的下降(P<0.05)。上述實驗數據說明洛伐他汀具有不依賴于降膽固醇作用的神經保護作用，可能與減少毒性Aβ二聚體的產生有關。

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(2016-10-15收稿，2016-11-28修回)

中文編輯： 劉 平； 英文編輯： 劉 華

Protective Effect of Lovastatin on SH-SY5Y Cells against β-amyloid Peptide in Non Cholesterol Dependence Way

ZHAO Liang1,2, GUAN Zhizhong2,3,4

(1.DepartmentofMicrobiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550025,Guizhou,China; 2.DepartmentofPathology,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 3.KeyLaboratoryofEndemicandEthnicDiseases,GuizhouMedicalUniversity,MinistryofEducation,Guiyang550004,Guizhou,China; 4.KeyLaboratoryofMedicalMolecularBiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

Objective: To observe the effect of lovastatin on APP670/671 gene over-expressed human neuroblastoma SH-SY5Y cell activity and the synthesis of dimer of beta amyloid protein(Aβ). Methods: The human APP670/671 gene was transfected into the SH-SY5Y cells and identified. The best concentration of lovastatin which had no cell toxicity and did not affect the cell cholesterol concentration was screened, which treated SH-SY5Y cells for 24 h. Then, CCK-8 test was used to detect the cell survival rate, and Western blot was adopted to detect the protein expression level of Aβ dimer. Results: The protein and mRNA levels of APP in SH-SY5Y/APPSWE cells were obviously higher than the SH-SY5Y wild type cells. No toxic effect and no changes in cholestetol level were observed in the cells treated with 0.1 μmol/L lovastatin for 24 h. 0.1 μmol/l lovastatin pretreatment of SH-SY5Y cells with 24 h could improve the survival rate of cells and decreased Aβ dimer secretion. Conclusions: Lovastatin has a neuroprotective effect, which may be related to reducing the toxic Aβ dimer synthesis.

lovastatin; β-amyloid protein; amyloid precursor protein; Alzheimer's disease

國家自然科學基金(81260173)； 教育部“長江學者和創新團隊發展計劃資助”(IRT13058)； 貴州省科技計劃[黔科合重大專項字(2014)6008號]； 貴州省創新計劃項目[黔教合協同創新中心(2014)06]

時間：2016-12-15

http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1164.R.20161215.1534.021.html

R749.16

A

1000-2707(2016)12-1370-06

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.12.002

**通信作者 E-mail:1457658298@qq.com