化學物(藥物)毒性測試替代體系的建立及應用

施 暢，馬華智，王全軍，吳純啟，原 野，石富江，荊淑芳，王建京，廖明陽

(軍事醫學科學院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室，北京 100850)

專題研究

化學物(藥物)毒性測試替代體系的建立及應用

施 暢，馬華智，王全軍，吳純啟，原 野，石富江，荊淑芳，王建京，廖明陽

(軍事醫學科學院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室，北京 100850)

當前對化學物進行毒性評價的整體動物試驗由于試驗周期長、成本高，存在種屬差異和劑量差異，導致其實驗結果在預測人體毒性風險時受到一定的限制。本研究針對化學物安全性評價及風險評估所依賴的毒作用終點(遺傳毒性、致癌性、生殖毒性、急性毒性、一般毒性)，按照動物試驗替代、減少、優化的“3R”原則，建立相應的毒性測試替代篩選體系。該體系涵蓋毒性評價的絕大多數終點，并結合分子生物學技術對毒性試驗進行整合，優化了多種動物試驗操作方法，以期縮短實驗周期、降低實驗成本、提高動物福利。同時該體系是基于毒作用機制進行的毒性評價，因此試驗結果具有較高的人體相關性。

毒性測試；替代策略；減少性替代；替代性研究；優化性替代

1 研究背景

1.1 化學物毒性測試面臨的挑戰

隨著科學技術、經濟和社會的快速發展，新化學物質不斷增多，人們在日常工作和生活中通過各種途徑接觸工農業產品、食品、日用和醫用化學品及空氣中的化學物質越來越多，其中大部分化學物缺乏系統的毒理學數據，難以正確評價其安全性，對人類和環境構成了潛在的危害。化學物的增多也導致時有潛在危害的存在及中毒事故的發生，因此急需對各種已知和未知的化學物進行毒性測試，以適應管理部門處理災情、制定衛生標準的需要，并保障產品安全和環境安全。

傳統的毒性測試主要依賴于整體動物試驗，由于以下幾方面原因，動物試驗難以滿足當前化學物毒性評價的巨大需求[1,2]。(1)實驗周期長、成本高。當前由于生產、生活的需要，新化學物質不斷被合成，人們接觸各類化合物的途徑和接觸量也隨之增多，可想而知對所有化合物進行毒性評價將耗費大量的時間、人力和財力。(2)動物試驗結果在預測人體毒性風險時存在一定的限制，主要有兩方面原因：一是實驗動物與人體存在種屬差異，動物實驗結果在用于預測人體毒性時需要進行種屬外推，且實驗動物遺傳背景、飼養環境和接觸化學物的途徑均相同，而現實生活中接觸化學物的人群則在遺傳背景、接觸途徑、個體生理環境等方面千差萬別；二是長期以來整體動物試驗所采用的劑量遠高于人體實際暴露量，因此動物實驗結果還存在劑量外推的問題。(3)整體動物試驗大多提供的是基于器官或細胞水平的毒性表現、毒作用特征、可能的毒作用靶器官以及毒性是否可逆，很少能夠提供確切的毒性機制和發生在亞細胞水平的有害作用的原發病因，難以為監管部門的風險評價、制定管理措施及處理災情等提供有用的信息。

1.2 “3R”原則和毒性測試替代策略“3R”原則的核心內容為減少( reduction )、替代( replacement ) 和優化( refinement)，其主要目的是在保證科學性的前提下，通過采用體外試驗、改進動物實驗的操作、改善動物生存的環境等措施減少實驗動物的使用，減輕因實驗操作導致動物的不適或痛苦，提高動物福利[3]。減少性替代是指使用較少的動物獲得相同的信息或者使用同等數量的動物獲得更多的信息，或縮短動物實驗周期。替代性研究主要是指采用無脊椎動物或人道獲取的脊椎動物細胞、組織、器官進行體外研究。優化性替代主要是指在動物飼養及試驗過程中，改善飼養環境，引入新技術新方法，優化實驗操作，以減輕動物的不適或痛苦。

目前歐盟、美國和日本等多個國家和地區已普遍制定了動物福利的法律法規，歐洲還成立了替代方法驗證中心，通過多渠道推廣貫徹“3R”原則。在我國“3R”原則的貫徹也取得了一些進展，如1997年科技部在《關于“九五”期間實驗動物發展的若干意見》中提出建立與國際接軌的動物福利保障制度，到2006 年科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》指出動物實驗應遵循“3R”原則。故此采用轉基因動物、體外培養的細胞、組織器官或低等生物等試驗系統替代傳統的動物實驗已成為化學物毒性測試的重要發展方向。同時計算機模擬程序和細胞分子生物學新技術新方法的引入，使得化學物毒性評價已發展為基于毒作用機制研究的的毒性測試新模式。

毒性測試替代策略即針對化學物的毒性或特定毒性終點(遺傳毒性、致癌性、生殖毒性、急性毒性、一般毒性等)，采用與傳統動物試驗毒性評價方式不同的體外、短期的測試方案對化學物進行毒性評價，在縮短實驗周期、降低實驗成本、提高動物福利的同時為危害識別和劑量-反應評估提供信息，由于該體系是基于毒作用機制進行的毒性評價，因此試驗結果具有較高的人體相關性。

2 研究目的及成果

本項目針對化學物毒性測試及風險評估所依賴的毒作用終點(遺傳毒性、致癌性、生殖毒性、急性毒性和一般毒性)，建立了相應的短期毒性測試替代方法，結合分子生物學技術對毒性試驗進行整合，并優化了多種動物試驗操作方法，以期縮短實驗周期、降低實驗成本、提高動物福利，取得良好的社會和經濟效益。

2.1 遺傳毒性測試替代方法

建立Ames波動試驗、小鼠淋巴瘤試驗(MLA)、質粒DNA斷裂試驗、體外微核試驗。

2.2 重復給藥毒性試驗伴隨微核試驗

建立流式細胞術檢測外周血微核方法，將體內微核試驗整合于重復給藥毒性試驗。

2.3 致癌性測試替代方法

建立轉基因小鼠短期致癌性試驗。

2.4 生殖毒性測試替代方法

建立大鼠胚胎中腦細胞微團培養試驗并優化大鼠胎仔骨骼染色法。

2.5 急性毒性測試替代方法

建立急性毒性上下法、固定劑量法和體外細胞毒性試驗方法。

2.6 一般毒性測試替代方法

優化了多種動物試驗操作方法，發明了一種擬生境型實驗猴籠，引進嚙齒類和實驗猴的環境裝飾，改進嚙齒類、Beagle犬和實驗猴的給藥和保定器械。

3 創新點

本項目建立的毒性測試替代篩選體系有如下創新點：1、全面系統：涵蓋毒性評價的絕大多數終點，實驗周期短，快速、高通量，所用樣品量少，可為化學物危險管理提供必須的非臨床研究資料。2、應用范圍廣：該系統既可應用于大量的藥物前體或候選藥物的早期毒性優化篩選，又可應用于法規毒理學試驗，并減少實驗動物的使用，縮短評價周期，大大降低人力、物力和財力。3、技術領先：以毒性作用機制為基礎，使毒性試驗結果具有較高的人體相關性；4、獲得實用新型專利：一種擬生境型實驗猴籠和一種胎仔骨骼批量染色箱。

4 討論

本項目建立的毒性測試替代篩選體系涵蓋了毒性評價的絕大多數終點，在實驗結果的一致性方面與當前傳統的毒性試驗相當，同時在減少動物使用、提高動物福利、縮短試驗周期、減少人力物力方面各有優勢。

在遺傳毒性方面，Ames波動試驗、小鼠淋巴瘤試驗、體外微核試驗與傳統的Ames試驗、哺乳動物染色體畸變試驗、哺乳動物骨髓細胞微核試驗相比，均有較高的一致性[4-6]，且MLA能夠同時檢出誘變劑和裂變劑，較動物體內染色體畸變或微核試驗檢測的突變譜更廣，體外微核試驗還避免了動物的使用。外周血微核流式細胞術檢測不僅可將微核試驗與一般毒性試驗進行整合，減少動物的使用，同時因無需人工閱片，大大減少了人力，提高效率，避免了人工閱片的主觀性。

致癌性試驗方面，哺乳動物長期致癌性試驗要求動物數多，消耗的化合物量大，耗時長，費用高，腫瘤自發率高，種類多，對病理人員的要求較高，結果的假陽性率和假陰性率高，敏感性特異性較低，腫瘤的發生與人類流行病學無一致性，因此外推至人較為困難。轉基因動物的短期致癌試驗周期短，使用動物數量少，化學物用量少，敏感性特異性均高于哺乳動物長期致癌性試驗[7]。

生殖毒性方面，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ段體內生殖毒性試驗貫穿整個生殖周期，動物和樣品的消耗量大，試驗操作較復雜，對實驗人員要求較高，顯然難以用于大量化學致畸物的快速篩選。大鼠胚胎中腦細胞微團培養試驗中，大鼠孕13 d的胚胎中腦神經細胞處于分化前期，對化學毒物的作用非常敏感，而且試驗周期短，重現性好，在致畸物的快速篩選方面有明顯優勢[8]。

急性毒性方面，傳統的以測定LD50值為目的的急性毒性試驗需耗費大量動物，隨著急性毒性試驗在化學物毒性評價中作用和地位的改變，急性毒性的檢測終點也發生了變化，并不一定都要得出LD50值。針對化學物的特點通過上下法或固定劑量法進行急性毒性，即能得到所需的相關信息，極大地減少了動物的使用。

此外，本項目發明的擬生境型實驗猴籠，引進的嚙齒類和實驗猴的環境裝飾，改進的嚙齒類動物、Beagle犬和實驗猴的給藥和保定器械均有助于提高動物福利、減輕動物痛苦。

本項目以委托課題的形式廣泛應用于國內多家單位，周期短、成本低，極大地支持了應用單位新藥的研發，取得了較好的社會和經濟效益，得到了應用單位的高度評價。

[1] Krewski D, Acosta D, Andersen M,etal. Toxicity testing in the 21st century: a vision and a strategy[J].J Toxicol Environ Health B Crit Rev,2010,13(2-4):51-138.

[2] 郭家彬，彭雙清.動物實驗替代方法與21世紀毒性測試發展策略[J].中國比較醫學雜志,2011,21(10):157-161.

[3] Bouvier d'Yvoire M, Bremer S, Casati S,etal. ECVAM and new technologies for toxicity testing[J]. Adv Exp Med Biol,2012,745:154-180.

[4] Kamber M, Flückiger-Isler S, Engelhardt G,etal. Comparison of the Ames II and traditional Ames test responses with respect to mutagenicity, strain specificities, need for metabolism and correlation with rodent carcinogenicity[J]. Mutagenesis,2009,24(4):359-366.

[5] Liviac D, Creus A, Marcos R. Mutagenic analysis of six disinfection by-products in the Tk gene of mouse lymphoma cells[J]. J Hazard Mater,2011,190(1-3):1045-1052.

[6] Doherty AT. The in vitro micronucleus assay[J]. Methods Mol Biol,2012,817(2):121-141.

[7] Jacobs AC,Brown PC.Regulatory Forum Opinion Piece*: Transgenic/ Alternative Carcinogenicity Assays: A Retrospective Review of Studies Submitted to CDER/FDA1997-2014[J]. Toxicol Pathol,2015,43(5):605-610.

[8] Knudsen TB，Kavlock RJ，Daston GP，etal．Developmental toxicity testing for safety assessment: new approaches and technologies[J]. Birth Defects Res B Dev Reprod Toxicol,2011,92(5):413-420.

Establishment and application of toxicity testing alternative system for chemicals(new drugs)

SHI Chang, MA Hua-zhi, WANG Quan-jun, WU Chun-qi, YUAN Ye, SHI Fu-jiang, JING Shu-fang, WANG Jian-jing, LIAO Ming-yang

(Beijing Institute of Pharmacology and Toxicology, State Key Laboratory of Toxicology and Medical Countermeasures, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China)

There are some shortcomings of animal experiments applied in chemical toxicity testing, such as long period, large cost, species differences and dose differences, which limit the use of animal experiments’ results in predicting human toxicity. Accordingly, we established a toxicity testing alternative screening system in line with the toxicity endpoints which required in chemical safety evaluation and risk assessment (genotoxicity, carcinogenicity, reproductive toxicity, acute toxicity and general toxicity) based on “3R” principles (replacement, reduction, refinement) for animal experiments. This system covers most of the endpoints of toxicity assessment, and molecular biology technology was also applied to integrate the toxicity test, as well as some operation was optimized in order to shorten the experimental period, reduce experimental costs, improve animal welfare. Furthermore, the results from the screening system have higher clinical relevance because it is based on the toxicity mechanisms.

Toxicity testing; Alternative strategy; Replacement; Reduction; Refinement

北京市科委科技計劃項目(H030230150130)；國家科技重大專項課題(2008ZX09305-003，2012ZX09301-003-008，2013ZX09301303)。

施暢(1972-)女，副研究員，研究方向：藥物毒理及臨床前安全性評價。E-mail： shichang1231@foxmail.com

R-33

A

1671-7856(2017) 05-0006-03

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.05.003

2016-11-18