蛇足石杉的研究進展

俞春英，沈曉霞，沈宇峰，孫 健

(浙江省中藥研究所有限公司，浙江 杭州 310023)

蛇足石杉的研究進展

俞春英，沈曉霞*，沈宇峰，孫 健

(浙江省中藥研究所有限公司，浙江 杭州 310023)

對蛇足石杉的資源分布、生物學特性、化學成分、繁殖技術和栽培種植方面的研究成果進行總結分析。

蛇足石杉； 石杉堿甲； 繁殖

蛇足石杉(Huperziaserrata(Thunb. ex Murray) Trev.)為石杉科石杉屬草本植物。《全國中草藥匯編》稱為千層塔，是蛇足石杉的藥材名，各地別名有蛇足草、金不換、千金榨等，畬藥名為石壁果果。蛇足石杉以干燥全草入藥，味苦、辛、微甘，性平，小毒，歸肺、大腸、肝、腎經，具有清熱解毒、生肌止血、散瘀消腫等功效[1]。現代研究表明，蛇足石杉中含有的石杉堿甲[2-3]是一種高效膽堿酯酶抑制劑[4]，具有治療重癥肌無力、中老年癡呆,以及提高記憶力、空間思維能力、結構推理能力等方面的作用[5]。優點為作用時間長，安全指數大，穩定性好，不良反應小等。目前的石杉堿甲類藥物的生產，依然以野生蛇足石杉為原材料，在提取率為100% 的情況下，提取1 kg的石杉堿甲，需消耗掉將近 10萬 kg的蛇足石杉。資源的短缺使得藥材價格暴漲，據統計，純天然石杉堿甲提取物在國際市場上的交易價格已到達50萬美元·kg-1[6-7]。自然條件下，蛇足石杉植株矮小，生長十分緩慢，年生長量僅 2.0～3.0 cm[8]，難以滿足市場需求，因此保護野生蛇足石杉資源已是當務之急。現對近年來有關蛇足石杉的資源分布、生物學特性、化學成分、繁殖技術和栽培種植方面的研究成果進行系統的綜述。

1 資源分布情況

1.1 概況

蛇足石杉生于海拔300～2 700 m的林蔭濕地下、灌叢下、路旁或溝谷石上。全國除西北地區部分省區、華北地區外均有分布。亞洲其他國家和地區如日本、朝鮮半島、東南亞、南亞、太平洋地區、俄羅斯、大洋洲、中美洲亦有[9]。

1.2 國內分布情況

蛇足石杉是一種廣泛分布于林下的小型草本植物，受上層植物遮蓋，在野外環境中很難精確地確定數量和生物產量。為更好地反映國內蛇足石杉資源狀況和天然生物量及可采量，吳葒等[10]在湖北(武當山、高嵐)、湖南(張家界、衡山)、廣西(桂林、大瑤山)、廣東(大明山、鼎湖山、靈霄山)、貴州(梵凈山、白水)、云南(南澗、峨山、文山、昆明)、浙江(天臺、臨安、平陽、樂清、杭州)、江西(井岡山、廬山)、福建(武夷)、河南(信陽)、四川(都江堰、峨眉山)、重慶、藏南東喜馬拉雅山等12省、區展開了野外實地調查，結果發現多數蛇足石杉的分布地位于風景區和自然保護區內，并初步確定我國蛇足石杉天然生物量為4 656.6 t，理論可采量為1 604 t，商業可采量不超過200 t。由此可見野生資源蘊藏量及商業可采量已經不能滿足日益增長的需求。

2 生物學特性

2.1 植物形態學

蛇足石杉是多年生蕨類植物[11]，株高10～30 cm，莖直立或下部平臥，具2叉分枝，頂端有時有芽胞，落地可生根成新苗，但在野外，生殖芽繁殖的現象極少。葉螺旋狀排列，具短柄，橢圓披針形，長1～2 cm，寬3～4 mm，基部楔形，邊緣有不規則的尖鋸齒，兩面光滑，有光澤，中脈突出明顯，薄革質。

孢子葉與不育葉同行，孢子囊生于葉腋，腎形，黃色，孢子[9-11]成熟時裂開，為淡黃色粉末。孢子萌發后，形成配子體(原葉體)。成熟的配子體為不規則的塊狀體，貼于土表層，通過菌根汲取營養。配子體產生的精子和卵子在水的環境下受精，發育成胚，暫時寄生在配子體上，長大后配子體死亡，孢子體即獨立生活。整個生長周期長達8～10年。

2.2 顯微特征

中國植物志根據植物分類學將蛇足石杉劃分在蛇足石杉組，蛇足石杉組[9]中有皺邊石杉、昆明石杉、四川石杉、亮葉石杉等12種石杉屬植物，其中只有蛇足石杉是中藥材千層塔的基源，為確保藥材基源的準確性，除了通過對植物形狀、大小等外觀鑒定外，還采用顯微技術進行鑒定。

根據內部結構[12]以及顯微特征發現蛇足石杉的根只具初生結構，分為表皮、皮層和維管柱3個部分。分生區先端具有3個大型的薄壁細胞，起著支撐和保護作用，成熟區沒有根毛，被真菌代替，通過真菌吸收養分。莖中的薄壁組織是莖的主要組成部分，生物堿結晶位于內外皮層間的薄壁細胞中，莖中的葉綠體位于近表皮的部分薄壁細胞中，說明莖也能進行光合作用。葉由表皮、葉肉、葉脈組成。葉上下表皮均有氣孔分布，以下表皮居多，生物堿結晶位于上表皮細胞內。葉肉細胞呈等徑形，內含大量葉綠體，可進行光合作用。生物堿主要存在于根的中柱木質部和莖的皮層薄壁細胞中，少數存在于葉肉細胞及其胞間隙中，含量大小順序為葉≈根>莖[13]。

關于蛇足石杉孢子的大小、形狀及表面紋飾，涂冬萍等[14]收集了廣東省6個縣的野生蛇足石杉資源，利用電鏡掃描，發現各居群的蛇足石杉孢子一般具有固定的輪廓及表面紋飾，孢子形態均為四面體型，輻射對稱，三裂縫，上被白色顆粒物，赤道面觀為近半圓或扇形，極面觀為鈍三角形，孔穴紋飾，有四分體痕。說明蛇足石杉的孢子受環境影響較小，但不同居群的孢子在極軸長、赤道軸長、極赤比、孔穴密集程度、裂縫形態及輻射區形態上有差異，這些可作為蛇足石杉資源多樣性的佐證。

3 生物堿成分研究及石杉堿甲合成

3.1 生物堿成分

早在1881年，有學者已經開始對蛇足石杉生物堿的研究，但直到1940年這方面的工作才得到廣泛的開展。1950年末到1960年初陸續揭示出其所含生物堿的結構。20世紀80年代，上海藥物研究所劉嘉森[15]從蛇足石杉中分離石杉堿甲，化學名稱(5 R，9 R，11E)-5-氨基-11-亞乙基-5，8，9，10-四氫-7-甲基-5，9-亞甲基環辛四烯并(b)吡啶-2-(1 H)-酮)和石杉堿乙。兩者都具有很強的抑制膽堿酯酶活性作用，特別是石杉堿甲，引起了國內外科學家們的廣泛關注，目前從中分離鑒定的生物堿已達到90多種[16]。

近年來，蔣金和等[17]首次從云南屏邊產的蛇足石杉中通過溶劑提取、硅膠柱層析等方法分離鑒定出11個化合物，6個生物堿分別為石杉堿甲、石杉堿乙、石杉堿庚、馬尾杉堿乙、8β-羥基馬尾杉堿乙、Iycoposerramine D，3個萜分別為serratenediol、21-episerratenediol、serratenediol-3-acetate和2個甾體分別為β-谷甾醇和胡蘿卜甙。鄭凱凱[18]等利用硅膠、反相硅膠、Sephadex HL-20等柱色譜進行分離純化，通過磁核共振、質譜等譜學數據鑒定化合物結構，共分離得到11個化合物，10個為石杉型三萜類化合物，1個為二苯并呋喃醇類化合物，并發現了1個新化合物—千層塔型香豆酸酯。

3.2 石杉堿甲提取與合成

石杉堿甲在蛇足石杉的含量僅為1/10萬，提高提取率及優化化學合成石杉堿甲都是有效的途徑。

石杉堿甲的提取工藝較多應用酸浸取、高效液相色譜、硅膠柱層析等分離法。以蛇足石杉為原料[19]，采用生物堿分離的傳統辦法，石杉堿甲的提取率能達到79.4%以上。張衛剛等[20]采用分析法對蛇足石杉中的石杉堿甲提取工藝進行優化，在乙醇濃度為90%，乙醇倍量7倍量，氨水調pH值9的條件下石杉堿甲的提取率為89.26%。

通過構建三碳橋環結構是合成石杉堿甲的關鍵[21]，近20年來石杉堿甲的合成從最初階段的消旋化合成到手性合成，反應步驟逐步減少，立體選擇性和總效率的不斷提高，都體現了合成領域的發展。但人工合成的石杉堿甲均有一定的局限性[22-23]，原料化合物的多步合成，催化劑配體的定制合成，提高了合成成本；合成的石杉堿甲中副產物較多，純度不夠；以及合成過程中產生的疊氮磷酸二苯酯，在工業化生產中存在危險性等等。由于石杉堿甲的生物活性極其有限的天然資源，國內外藥物化學工作者對石杉堿甲的合成，類似物及衍生物的合成，做了大量工作，至今僅有個別類似物能達到天然石杉堿甲的活性[24]。

蛇足石杉植株內含有豐富的內生真菌，近年來，不少科學家嘗試從其內生菌的次級代謝產物中提取石杉堿甲，韓文霞等[25]采集了四川的野生蛇足石杉，經內生真菌分離純化后再經液體發酵，篩選出了尖鐮孢(鐮刀菌)，其發酵液中石杉堿甲含量為11.1 mg·L-1，還遠遠達不到商業化生產的要求。

4 組織培養技術和扦插繁殖技術

4.1 組織培養技術

組織培養如以蛇足石杉的莖尖為外植體，采用不同濃度的次氯酸鈉溶液、升汞溶液，經過多次滅菌，仍然很難解決莖尖污染問題。在刮去表皮的莖段的試驗中發現，內源真菌[26]存在于莖段的皮層，至少在表皮組織內。

為探討蛇足石杉中的內生真菌含量是否會隨季節變化而變化，汪學軍等[27]分別采收8月、10月以及次年2月的蛇足石杉植株進行內生菌研究，結果發現2月收集的蛇足石杉內生真菌數量最少，為外植體的選擇提供了依據。劉江海等[28]以蛇足石杉活體莖尖為外植體，利用多種消毒劑進行表面消毒以及用孔雀石綠、原子吸收光譜聯合殺滅內生真菌，得到無菌苗二叉分枝，經4次二叉分枝繼代培養后，得到數量不等的側芽，最多的植株可產生14個側芽，但側芽撥離、接種后死亡率較高。蛇足石杉莖尖誘導叢生芽和綠色小體的試驗[29]中發現最為適宜的蔗糖濃度為2%和4%，平均每團綠色小體可分化出16株叢生芽。

在自然條件下，蛇足石杉的繁殖方式主要是孢子繁殖和芽胞繁殖，但萌發較為困難。駱冰潔等[30]在蛇足石杉芽胞萌發的試驗中發現將芽胞接種于Moore培養基，暗培養，溫度為(22±2)℃，芽胞的萌發率較高。韋景楓等[31]以孢子囊為外植體，在0.1%的氯化汞滅菌4～5 min，污染率高達93.5%，說明孢子囊內部可能也存在豐富的內生真菌。孢子在1/2 MS+GA35 mg·L-1的培養基上培養，培養溫度控制在25～28 ℃，219 d后孢子萌發。包日雙[32]以孢子囊為外植體得到蛇足石杉的原葉體，原葉體在無激素的MS培養基培養60 d后，增殖倍數達到131.1。培養90 d后，孢子體誘導率為4.0%，其中以11—12月采收的孢子萌發率較高。

4.2 扦插繁殖技術

蛇足石杉植物中內生真菌的存在，給組織培養技術帶來了巨大的困難，扦插繁殖技術成為另一條大量繁殖蛇足石杉的途徑。選取5～8 cm的健壯頂芽插條，經不同濃度的萘乙酸、吲哚丁酸、生根粉浸泡[33]，扦插于腐殖土與河沙的混合土壤的基質中，其中以2 000 mg·L-1吲哚丁酸處理后的插條效果最好，2次觀察的發根率為90%～100%。龍華等[34]認為，6 cm的插條在萘乙酸質量濃度為20 mg·L-1中浸泡5 min,90 d后的成活率達到90%。覃大吉等[35]研制的蛇足石杉NFT扦插育苗技術中，以1 000 mg·L-1吲哚丁酸+1/8 MS無機營養液，98 d后，插條生根率達到98%。

5 栽培技術

解決人工培植技術難題的重要前提是充分了解蛇足石杉天然居群的生態因子及居群特點。從野生蛇足石杉分布來看，海拔分布相對較廣，從50 m到2 700 m的山地密林下或溝谷陰濕土均有分布。居群環境具空氣濕度大，年均降水量和郁閉度高等特點[9-10]。

根據蛇足石杉[36-37]自然群居結構、原生境土壤養分、酸堿度及空氣溫濕度等的調查測定發現，自然群居結構分為集中分布居群、分散分布居群2種。其中集中分布居群主要由幼苗和幼株構成，占居群植株的80%左右，更新能力較強，但要注意植株間的距離，避免過密導致幼苗的死亡，減弱其更新能力。

pH值為4.75～5.31的偏酸性土壤有利于蛇足石杉集中分布居群的形成[38-39]，且蛇足石杉對K、Ca、Zn和Na的需要程度較高，對Pb、Cu、Cd 3種重金屬元素的富集能力較強，在人工栽培中應注意協調各元素的合理配給，注意土壤酸堿度的調控。

適宜的溫度[40]是蛇足石杉生長發育的必要條件，過高或過低的溫度脅迫會抑制植物的整個發育過程。分別在25、30、35、40 ℃的溫度處理蛇足石杉，通過測定葉片中的可溶性糖、可溶性蛋白質、游離脯氨酸含量及超氧化物歧化酶、過氧化物酶的活性，并對其進行相關性分析，表明蛇足石杉適宜生長溫度在25～30 ℃，持續35 ℃對生長有明顯的影響，40 ℃為極限高溫，短期內會引起死亡。王志安等[41]在浙江安吉的毛竹林下仿野生種植蛇足石杉，光照強度控制在1 330～3 000 lx[42]，相對濕度控制在80%以上，經過2年的自然栽培，蛇足石杉生長情況良好，能夠正常萌芽，并能在新芽的葉腋內產生孢子囊，在開裂后釋放孢子。

6 小結與展望

目前以石杉堿甲為原料的哈伯因、雙益平等藥品已獲得國家食品藥品監督管理局的批準，并已上市。需求的猛增，高利益的誘惑直接導致蛇足石杉野生資源被無節制地采挖，使野生蛇足石杉瀕臨滅絕。

人工合成石杉堿甲不僅有利于緩解市場需求，還能有效的保護野生蛇足石杉資源。雖然人工合成石杉堿甲技術已有一定的進展，但目前人工合成的石杉堿甲的乙酰膽堿酯酶抑制活性不強，無法與天然提取的石杉堿甲相比。因此，優化石杉堿甲的提取工藝，提高石杉堿甲的提取率，以及選育高含量的蛇足石杉品種，可作為今后的努力方向。通過提取內生菌的次級代謝產物，可作為天然活性產物—石杉堿甲的又一來源，但目前產生的石杉堿甲較少。今后可通過優化培養條件、加入刺激物、篩選高產突變菌株和基因工程等手段來提高石杉堿甲產量。

蛇足石杉為低等蕨類植物，自然條件下蛇足石杉生長緩慢，繁殖能力弱，根據蛇足石杉的資源分布情況，天然的常綠闊葉林和季風常綠闊葉林及其退化的次生生態系統，以及人工柳杉林或陰坡的人工杉木林、毛竹林都是蛇足石杉最適宜的種植地。研究及了解蛇足石杉天然居群的生態因子及居群特點(如溫度、濕度、光照)等因素，結合林下仿野生栽培技術，有利于保護稀缺中藥資源，促進中藥資源的可持續利用。

近年來，利用組織培養快繁技術，以蛇足石杉的莖尖、孢子、孢子囊等為外植體，均發現蛇足石杉中含有內生真菌。以孢子囊為例，孢子囊中含有大量的內生真菌，通過表面滅菌，并不能達到很好的效果，作者根據現有文獻中的方法進行試驗，未能得到蛇足石杉的原葉體，可能是由于采收孢子囊的季節不同。作者認為，篩選出一種適合內生真菌和外植體共同生長的培養基可作為今后組培研究的方向；側芽剝離后，造成側芽死亡等問題也有待進一步的深入研究。

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2017-10-11

浙江省科技計劃項目(2016C32044)

俞春英(1992—)，女，浙江杭州人，技術員，大專，研究方向為農學，E-mail:kekedou_ing@163.com。

沈曉霞(1972—)，女，浙江海寧人，教授級高級工程師，碩士，研究方向為育種，E-mail:xiaoxiashen@sina.com。

文獻著錄格式：俞春英，沈曉霞，沈宇峰，等. 蛇足石杉的研究進展[J].浙江農業科學，2017，58(12)：2179-2183.

10.16178/j.issn.0528-9017.20171230

S567

A

0528-9017(2017)12-2179-05

張才德)