碘過量不同處理時間對Fischer大鼠甲狀腺細胞線粒體過氧化損傷的影響

包建忠 張震宇 葉紅波 黃 鈺 彭 琪

(深圳市坪山新區婦幼保健院藥劑科，廣東 深圳 518122)

碘過量不同處理時間對Fischer大鼠甲狀腺細胞線粒體過氧化損傷的影響

包建忠 張震宇 葉紅波 黃 鈺 彭 琪

(深圳市坪山新區婦幼保健院藥劑科，廣東 深圳 518122)

目的探討碘過量不同處理時間對Fischer大鼠甲狀腺細胞線粒體過氧化損傷的影響。方法采用含0(對照組)、0.1 mmol/L碘化鉀的Coons F12培養基培養Fischer大鼠甲狀腺細胞2、6 h、1 d，對小鼠抗大鼠細胞色素C蛋白、死亡細胞百分比、線粒體超氧化物生成、乳酸脫氫酶活力進行檢測分析研究。結果0.1 mmol/L碘化鉀組處理2 h、6 h、1 d時，小鼠抗大鼠細胞色素C強陽性細胞率遠高于對照組(P<0.05)；Fischer大鼠甲狀腺細胞線粒體超氧化物生成明顯高于對照組(P<0.05)，且處理2 h時增長幅度最大；隨著0.1 mmol/L碘化鉀處理時間的增加，培養液上清中乳酸脫氫酶活力程序持續增加趨勢，處理2、6 h、1 d時乳酸脫氫酶活力明顯高于對照組(P<0.05)。結論碘過量處理2 h可能會導致Fischer大鼠甲狀腺細胞線粒體發生過氧化損傷，而處理1 d則極有可能導致細胞凋亡。

碘過量；Fischer大鼠；甲狀腺細胞線粒體；過氧化損傷

碘對甲狀腺濾泡上皮細胞的分泌和生長具有重要作用。研究表明〔1〕，對碘具有較高敏感性的人，尤其是患有隱性甲狀腺疾病者，攝取過多碘會引發或加重機體免疫性甲狀腺疾病。運用5、20 mmol/L碘化鉀對不滅的甲狀腺細胞系進行48 h處理，可有效延緩甲狀腺細胞生長，促使細胞壞死或凋亡〔2〕。此外，產生細胞中活性氧的主要場所為線粒體，同時也是凋亡觸發的靶點。本研究探討碘過量不同處理時間對Fischer大鼠甲狀腺細胞線粒體過氧化損傷的影響。

1 材料與方法

1.1儀器及試劑 (1)流式細胞儀；倒置熒光顯微鏡；(2)DNA ladder檢測試劑盒；乳酸脫氫酶活力檢測試劑盒；山羊抗小鼠二步法免疫組化試劑盒；小鼠抗大鼠細胞色素C單克隆抗體及線粒體超氧化物指示劑。

1.2細胞培養 將Fischer大鼠甲狀腺細胞放置于Coons F12培養基中，將0.25%鏈霉素、0.25%青霉素、1 U/L促甲狀腺激素、0.3 g/L谷氨酰胺、5.0 μg/L氫化可的松、5.0 mg/L轉鐵蛋白、10.0 mg/L胰島素及5.0%新生小牛血清加入其中，隨后放于37℃的100.0%濕度培養箱中，每間隔4 d更換1次液體。

1.3處理方法 采用含0(對照組，n=6)、0.1 mmol/L碘化鉀的Coons F12培養基培養Fischer大鼠甲狀腺細胞2 h、6 h、1 d(n=6)。

1.4小鼠抗大鼠細胞色素C蛋白 首先處理細胞爬片，隨后通過免疫組化二步法對小鼠抗大鼠細胞色素C蛋白進行檢測；評定標準為強陽性：棕黃色粗大顆粒；陽性：黃色中等大小顆粒；弱陽性：淡黃色細小顆粒。每個爬片選擇5個400倍視野，每個視野計數100個細胞，統計強陽性細胞總數后計算強陽性細胞率，強陽性細胞率=(強陽性細胞總數/細胞總數)×100.0%。

1.5死亡細胞百分比檢測 在6孔板接種Fischer大鼠甲狀腺細胞，進行3 d貼壁培養，并通過0.1 mmol/L碘化鉀處理2、6 h、1 d，隨后收集貼壁細胞，并進行10 min離心；隨后通過70%乙醇對其進行固定處理，放置在4℃環境中過夜保存；將200 mg/L RNA酶和50 mg/L 碘化丙啶與其混合；利用流式細胞儀對其亞二倍體峰進行測定，死亡細胞百分比=(亞二倍體細胞總數/細胞總數)×100.0%。

1.6線粒體超氧化物生成檢測 將已完成處理的Fischer大鼠甲狀腺細胞放入5.0 μmol/L 線粒體超氧化物指示劑中，放置在37℃的環境中避光放置0.5 h；通過流式細胞儀對線粒體超氧化物指示劑平均熒光強度進行測定，并利用線粒體超氧化物指示劑平均熒光強度反應線粒體超氧化物生成量。

1.7乳酸脫氫酶活力檢測 通過比色法對乳酸脫氫酶活力進行測定。

1.8統計學方法 應用SPSS19.0軟件進行χ2檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1小鼠抗大鼠細胞色素C蛋白檢測結果 對照組細胞呈上皮樣生長，胞膜較為完整，胞核為橢圓形，體積較大，生長狀態較為良好，且以細胞質中有均衡分布的淡黃色小鼠抗大鼠細胞色素C陽性顆粒的細胞為主；0.1 mmol/L碘化鉀處理2 h后，細胞質中有棕黃色的粗大小鼠抗大鼠細胞色素C陽性顆粒的細胞數增加，并且部分細胞膜發生缺損；0.1 mmol/L碘化鉀處理6 h后，細胞質中有棕黃色的粗大小鼠抗大鼠細胞色素C陽性顆粒的細胞數與處理2 h相比更多，并且顏色更深；0.1 mmol/L碘化鉀處理1 d后，棕黃色顆粒完全包圍藍色細胞核，并可發現細胞發生破碎，小鼠抗大鼠細胞色素C顏色變淡。0.1 mmol/L碘化鉀組處理2、6 h、1 d時，小鼠抗大鼠細胞色素C強陽性細胞率(34.2%±3.5%，44.7%±5.4%，30.2%±6.0%)遠高于對照組(13.7%±1.1%，P<0.05)。

2.2死亡細胞百分比檢測結果 0.1 mmol/L碘化鉀處理2、6 h、1 d時死亡細胞百分比(7.41%±0.11%，9.18%±0.13%，12.69%±0.15%)均明顯高于對照組(4.55%±0.19%)(P<0.05)，且隨著處理時間的增長，死亡細胞比例持續升高。

2.3線粒體超氧化物生成檢測結果 0.1 mmol/L碘化鉀處理Fischer大鼠甲狀腺細胞2 h，線粒體超氧化物指示劑平均熒光強度高達對照組的5.19倍，處理6 h高達2.18倍，處理1 d高達2.03倍。經熒光顯微鏡輔助可知，對照組細胞質中紅色的線粒體超氧化物指示劑熒光強度較弱；0.1 mmol/L碘化鉀處理2 h后，熒光強度顯著增強，表明線粒體超氧化物生成顯著提升；而處理6 h及1 d時熒光強度開始下降，表明與處理2 h相比，線粒體超氧化物生成降低，但依舊高于對照組。

2.4乳酸脫氫酶活力檢測結果 隨著0.1 mmol/L碘化鉀處理時間的增加，培養液上清中乳酸脫氫酶活力程序持續增加趨勢，處理2、6 h、1 d時乳酸脫氫酶活力〔(1.74±0.21)U/mg、(6.52±0.13)U/mg，(8.24±0.23)U/mg〕明顯高于對照組〔(0.78±0.03)U/mg，P<0.05〕。

3 討 論

Fischer大鼠甲狀腺細胞具備甲狀腺細胞大部分特征及生理功能，如碘化酪氨酸、甲狀腺過氧化物酶及甲狀腺球蛋白等，并且具有碘/鈉轉運體，但無法構成甲狀腺組織中的濾泡結構，也無法在培養基中生成游離的甲狀腺素及三碘甲腺原氨酸等物質〔3〕。有研究表明〔4〕，在狗和人的甲狀腺結構中，低劑量或中等劑量的碘可對一系列促甲狀腺素介導的甲狀腺效應產生阻滯作用，如碘/鈉轉運體及甲狀腺過氧化物酶的表達、環磷酸腺苷的合成等。碘含量過高會對甲狀腺球蛋白碘化產生干擾作用，進而使甲狀腺激素的合成過程發生中斷〔5〕。

在正常情況下，甲狀腺組織能夠生成過氧化氫，并使之合成甲狀腺激素。就生成部位而言，產生H2O2的重要來源為內質網和線粒體生成的超氧陰離子〔6〕。本研究中，采用0.1 mmol/L碘化鉀處理2 h時，Fischer大鼠甲狀腺細胞中線粒體超氧化物指示劑熒光強度顯著增加，表明細胞中生成了大量超氧化物，并且發生線粒體過氧化損傷。而處理6 h及1 d后，指示劑熒光強度仍高于對照組，表明在過量碘化鉀的不斷刺激處理下，Fischer大鼠甲狀腺細胞中線粒體超氧化物生成持續增加，并且繼續氧化損傷線粒體。其主要原因可能為：(1)通過cAMP通路，碘對甲狀腺細胞發揮刺激性作用，進而生成H2O2；(2)碘量過高時，H2O2消耗量降低，引發活性氧蓄積〔7，8〕。由于生成H2O2，甲狀腺過氧化物酶發生氧化，形成氧化復合物Ⅰ(CPDI)，該物質可接受一個電子形成復合物Ⅱ，進而生成一個自由基，形成一個氧化-還原循環過程。該循環過程必須精確、穩定，當氧化趨勢增強時，則會形成游離的H2O2、超氧陰離子及過氧化脂肪酸等；當碘量異常增加時，則會對催化樣活性發生抑制，從而生成大量自由基，并且會導致甲狀腺細胞中聚集大量以氧化形式存在的碘，此類物質如果過多潴留在甲狀腺細胞中會對微粒體、線粒體及細胞膜造成嚴重損傷，破壞甲狀腺組織的正常功能，嚴重者會引發甲狀腺萎縮。

本研究結果表明，在早期經高碘處理可導致Fischer大鼠甲狀腺細胞線粒體發生氧化損傷，破壞線粒體膜的完整性，并且有細胞色素C釋放至細胞質，隨著處理時間的增加，細胞膜被破壞程度不斷增加，最終會導致細胞發生壞死及凋亡。有研究資料指出〔9〕，凋亡機制的開關為線粒體，線粒體不僅是損傷效應的靶點，同時也是生成活性氧的重要部位。線粒體呼吸鏈可生成細胞中大量活性氧，活性氧可對DNA、脂質及線粒體蛋白直接發揮作用，進而影響其正常生理功能。心磷脂過氧化等多種脂質過氧化反應是引發凋亡關鍵性事件發生的重要因素。

1楊 宇，吳敏范，梁 宇，等.異鉤藤堿對多發性抽動癥模型大鼠頭部抽動行為與腦內單胺遞質水平的影響〔J〕.中華行為醫學與腦科學雜志，2016；25(1)：29-33.

2葛東宇，李春盈，姚小芹，等.清金化痰湯對 COPD 模型大鼠肺組織中性粒細胞彈性蛋白酶及黏蛋白5AC 表達的影響〔J〕.吉林中醫藥，2016；33(1)：65-71.

3王滌非，李國姣，董玉梅，等.間歇性高糖對大鼠胰島細胞瘤細胞系Ins-1的損傷作用及對第10號染色體缺失的張力同源性磷酸酶表達的影響〔J〕.中華糖尿病雜志，2015；7(11)：689-93.

4Hosseini-Zijoud SM,Ebadi SA,Goodarzi MT,etal.Lipid peroxidation and antioxidant status in patients with medullary thyroid carcinoma:a case-control study〔J〕.J Clin Diagn Res,2016；10(2):BC04.

5楊國慶，韓為東，母義明，等.骨髓間充質干細胞對糖脂毒性誘導的大鼠胰島素瘤細胞損傷的保護作用〔J〕.中華糖尿病雜志，2015；7(5)：316-20.

6薛富善，崔昕龍，王世玉，等.不同濃度PNU282987對大鼠心肌細胞缺氧/復氧損傷的影響〔J〕.中華麻醉學雜志，2015;35(7)：790-3.

7王世英，時 軍，陳寶平.活性維生素D對糖尿病腎病大鼠足細胞損傷的抑制效果及其可能機制〔J〕.中國老年學雜志，2015;35(20)：5700-2.

8敖強國，王曉華，程慶礫，等.糖尿病大鼠腎小管間質早期病變及腎康注射液的干預治療〔J〕.中華醫學雜志，2015;95(4)：289-93.

9馬軍建，王燕玲，王俊玲，等.甲狀腺功能減退對雄性大鼠睪丸c-fos和c-jun基因mRNA表達的影響〔J〕.中華地方病學雜志，2016;36(1)：27-31.

〔2017-03-11修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

R965.1

A

1005-9202(2017)18-4476-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.019

廣東省衛生廳資助項目(No.WSTJJ20121204)；深圳市坪山新區醫療衛生發展孵化資助資金課題(No.201333)

包建忠(1974-)，男，主管藥師，主要從事藥學研究。