酶聯免疫吸附法在口蹄疫診斷中的研究進展

（重慶市六九畜牧科技股份有限公司）

酶聯免疫吸附法在口蹄疫診斷中的研究進展

張 亮

（重慶市六九畜牧科技股份有限公司）

口蹄疫屬于我國一類動物疫病，防治該病的關鍵是做出及時、準確的診斷。本文介紹了ELISA方法在口蹄疫診斷中的應用研究進展，傳統ELISA方法包括液相阻斷ELISA、間接ELISA、固相競爭ELISA、間接夾心ELISA；新型ELISA方法包括單克隆抗體ELISA、PCR-ELISA、生物素-親和素ELISA及Dot-ELISA。隨著技術的進步及養殖領域的規模化，ELISA 在臨床診斷和流行病學調查中將會有更加廣泛的應用。

口蹄疫；診斷方法；酶聯免疫吸附試驗

口蹄疫（FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)感染引起的偶蹄動物共患的一種烈性傳染病。該病發病率極高，對畜牧業生產及國際貿易影響嚴重，因而備受重視。酶聯免疫吸附試驗（ELISA）的基本原理是將抗原或者抗體吸附于固相載體，在載體上進行免疫酶反應，通過底物顯色后用肉眼或者分光光度計判定結果。作為一種新的免疫診斷技術，ELISA自20世紀70年代初問世以來發展十分迅速，被廣泛用于生物學和醫學的各個領域。

1 傳統ELISA檢測FMDV

1.1 液相阻斷ELISA

Hamblin等[1]于1986年以病毒中和試驗（VNT）和液相ELISA實驗原理建立了用于檢測FMD抗體的液相阻斷ELISA，并做了液相阻斷ELISA與VNT的比較試驗，結果顯示相關系數在0.8以上，屬高度相關。

液相ELISA與VNT比較，最大的優點就是使用滅活的抗原，無需擔心散毒，也使FMD的診斷從實驗室走向了普通養殖場。液相阻斷ELISA主要應用于2個方面：1)檢測FMD病毒感染；2)檢測免疫抗體，評價FMD疫苗免疫效力，這也體現出疫苗免疫動物后該動物抵抗強毒的攻擊能力。不足的是該方法檢測結果可能會出現一定的假陽性。

1.2 間接ELISA

間接ELISA方法是以口蹄疫病毒蛋白為包被抗原，用來檢測動物血清樣品中的抗體水平，可用于鑒別感染動物和疫苗免疫動物。與其他ELISA的區別在于直接將病毒抗原包被于板上，簡單易操作，且具有較高的敏感性。2003年朱彩珠等[2]利用非結構蛋白建立了間接ELISA方法，用于區分FMDV感染動物和疫苗免疫動物，試驗結果證明，該ELISA方法的靈敏度比病毒感染相關抗原瓊脂糖凝膠免疫擴散試驗高。2010年張潤祥等[3]建立了牛口蹄疫抗體的檢測方法，重復性試驗表明，批內批間變異系數均小于10%，檢測非免疫無口蹄疫國家的牛陰性血清的特異性為100%；檢測感染血清敏感性為97.3%；檢測O-AsiaⅠ二價苗免疫牛血清，與4種商品化試劑盒比較，其符合率分別為69.0%、95.0%、90.4%和86.8%，符合率較高，說明這種ELISA有良好的應用價值。

1.3 間接夾心ELISA

間接夾心ELISA用于檢測大分子抗原，它不僅不必標記每種抗體，還可提高實驗的敏感性。該方法與補體結合試驗相比，前者的敏感性遠大于后者，并且克服了補體結合試驗樣品定型率低的缺點。對于含毒量較高的樣品，如新鮮的水泡皮和細胞培養物可在2～4 h內獲得結果，如使用預先在實驗室包被的免疫反應板及凍干劑，將更便于現場檢測。在國內，2007年吳國華等[4]進一步發展了間接夾心ELISA，建立了口蹄疫O，A，Asia I各血清型間接夾心ELISA方法，檢驗證明該方法具有良好的特異性和敏感性，批內重復變異系數在10%以下，具有很好的重復性，并且該ELISA診斷方法可應用于口蹄疫病毒的定型診斷。

間接夾心ELISA用滅活的沉降系數為146s的完整FMDV粒子制備抗血清或作抗原，既可在一般實驗室操作，也可制成試劑盒用于農場檢測。該法可根據檢測目的不同用雙抗夾心法及其變法進行病毒抗原的檢測，也可用阻斷夾心法等測定血清中的病毒抗體。

1.4 固相競爭ELISA

固相競爭ELISA法除具有液相阻斷ELISA的優點外，還具備特異性更高、操作更為簡便、結果更穩定等特點。但固相競爭ELISA由于需要大量的洗滌過程，減緩了樣品的檢測速度，所以在疾病暴發期間不能對大量的樣品進行快速的檢側。

2008年林密等[5]建立了O型FMDV固相競爭ELISA抗體檢測方法，并確立了O型FMDV固相競爭ELISA抗體檢測方法檢測O型FMD血清陽性判定標準：抗體效價大于或等于1∶32時判為O型FMD抗體陽性；1∶16至1∶32時判為O型FMD抗體可疑。

2 新型ELISA檢測FMDV

2.1 生物素－親和素ELISA

親和素和生物素結合特異性與親和力都很強，兩者一經結合就極為穩定。因此把親和素和生物素與ELISA偶聯可大幅提高ELISA的敏感性。親和素-生物素系統在ELISA中的應用有多種形式，可用于間接包被，也可用于終反應放大，還可在固相載體上預先包被親和素，然后把抗原或抗體與生物素結合，通過生物素-親和素反應使抗原或抗體吸附于固相載體，這種包被法不僅可增加吸附抗原或者抗體量，而且可以使其結合位點充分暴露。

1992年Sorensen等[6]建立了可檢測FMDV SAT1、SAT2和SAT3血清抗體的阻斷ELISA方法，在這個方法中使用了生物素－親和素系統。他們用此方法與世界參考實驗室的液相ELISA方法進行了比較，結果證實該方法具有高特異性和靈敏性，可作為抗體水平評估的一種精確可行的方法。

2.2 單克隆抗體ELISA

單克隆抗體（McAb）具有高度均質性和高度特異性，是檢測抗原位點的最佳分子探針，而ELISA對結果判斷比較客觀，敏感性和特異性比較高，因此近年來很多學者試圖通過結合兩者的優點來大幅提高ELISA檢測方法的準確性。他們建立的方法有直接用純化抗原包被酶標板用于檢測待測血清，也有基于單克隆抗體的間接捕獲ELISA、競爭ELISA方法，均具有敏感性高、重復性好、結果判定準確的特點。

2009年Morioka等[7]以單克隆抗體建立了直接夾心ELISA（SMDELISA），這種ELISA能從臨床樣品（血漿和唾液）中檢出FMDV抗原，陰性檢出率很低。其結果與RT-PCR檢測結果高度一致，并且這種夾心ELISA對于每一個稀釋度的血清型抗原檢測結果都顯示了比世界動物衛生組織推薦使用的間接夾心ELISA方法具有更高的光吸收度，顯示出其有極高的敏感性。

很多實驗室為提高感染動物和疫苗免疫動物的區分率，開發出了FMDV非結構蛋白和單克隆抗體相結合的ELISA。FMDV非結構蛋白2C[8]，3A[9]，3B[10]，3D[11]的單克隆抗體已經被成功制備，李永亮等[10]用3B單克隆抗體建立了液相阻斷ELISA方法，該方法能特異、敏感地檢測到病毒培養液中的非結構蛋白3B成分，并能進行定量。相信在不久的將來，2C、3A、3D單克隆抗體也會應用到口蹄疫的ELISA當中。

2.3 RT-PCR ELISA

RT-PCR ELISA是將PCR技術與ELISA相結合的一種抗原檢測技術，又稱免疫PCR。該方法的特點是利用PCR反應的指數級擴增效應帶來極高的敏感性，同時又具有高特異性的抗原檢測系統。其原理是用生物素標記寡核苷酸探針，用鏈霉親和素包裹微孔反應板，封閉后加入生物素標記的探針與之結合，樣本經PCR擴增（在PCR緩沖液中加入一定比例的地高辛標記的dUTP）后，擴增產物與生物素標記探針進行液相雜交，然后加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的抗地高辛抗體，加入底物顯色，進行ELISA檢測。

Barlic-Maganja等[12]建立了一種RT-PCR ELISA用來檢測FMDV，RT-PCR在免疫檢測單孔雜交試驗中放大產品。

RT-PCR ELISA具有高靈敏度、檢測結果可靠、可進行半定量檢測等優點，可用于病毒檢測、疾病診斷和目的基因的檢測。與抗原ELISA相比，RTPCR ELISA方法可以對體積小但數量巨大的口蹄疫病毒滅活材料進行檢測。

2.4 Dot-ELISA

Dot-ELISA的基本原理與常規ELISA一樣，即將抗原或抗體包被于纖維素膜上，經膜的吸附和富集作用，通過與相應酶標抗體或酶標抗原形成標記抗原抗體復合物，再經酶促反應使底物變色，最后以纖維素膜上斑點的有無及色澤深淺來判定結果。由于濾膜載體具有對蛋白質進行吸附、吸收水分、濃縮聚集等作用，所以盡管包被用的抗原或抗體量少，但膜上中心點單位面積的抗原或抗體濃度遠遠高于常規ELISA，從而大大提高了敏感性。并且Dot-ELISA可以作為區分自然感染和疫苗免疫動物的有效方法

利用生物素-親和素系統生物放大作用而建立的ABC-Dot-ELISA更進一步提高了Dot-ELISA的敏感性。楊永欽等[13]研制出用于檢測FMDV的ABCDot-ELISA試驗方法，用光敏素標記的純化A蛋白(SPA)代替第二抗體，通過堿性磷酸酶(AP)標記的親和素檢測生物素化抗體，最后加底物5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(BCIP)和四氯唑藍(NBT)顯色判定，該法具有良好的重復性和特異性，樣品用量少，不需特殊儀器、縮短檢測時間等特點。由于引入生物素系統和AP，使靈敏度大大提高，能檢出微量抗體，比常規ELISA更為敏感。

3 總結與展望

ELISA與其他免疫學檢測技術相比具有靈敏、特異、廉價、快速、穩定且易于實現自動化操作等優點，因此不僅適用于大量臨床標本的檢測，也適合血清流行病學調查，目前在國內許多中型養殖場即配備，使用范圍廣。另外ELISA還有一個顯著的優點：既可以用來檢測抗原，也可以用于檢測抗體。而在檢測抗體中避免了對活病毒的操作，非常適合在普通實驗室使用。

現在研究人員正在不斷地優化反應條件，簡化實驗步驟，使ELISA更靈敏穩定而又操作方便，有報道[14]一種同源分析的新型ELISA也許會應用于診斷FMD的血清學試驗中，這種新型ELISA不需要洗板，因此比傳統的ELISA方法更適合于機器操作，如果這種方法得到推廣，不僅節省人力、大大加快檢測速度，而且減少了人工操作產生的誤差。可以預見，ELISA檢測技術在臨床診斷和流行病學調查中將會得到更為廣泛的應用。

[1] HAMBLIN C, BARNETT I T.HEDGER R S. A new enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of antibodies against footand-mouth disease virus. I. Development and method of ELISA[J]. J Immunol Methods, 1986. 93(1)﹕115-21.

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[11] 田美娜，李永亮，盧曾軍，等.口蹄疫病毒非結構蛋白3D單克隆抗體的制備及鑒定[J].細胞與分子免疫學雜志,2009,25(7)﹕ 625-627.

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[14] 閆海濱，趙剛，朱江巍，等.口蹄疫診斷技術的研究進展[J].現代畜牧獸醫,2010(4)﹕ 66-69.

2016-11-16）

張亮（1990-），男，重慶開州人，碩士，預防獸醫學，主要從事藥物代謝酶基因檢測。