大鼠miR-24腺病毒載體構(gòu)建和鑒定

楊 簡 范致星 楊 俊 丁家望 楊超君 曾 萍

(三峽大學心血管病研究所 三峽大學第一臨床醫(yī)學院心內(nèi)科，湖北 宜昌 443003)

大鼠miR-24腺病毒載體構(gòu)建和鑒定

楊 簡 范致星 楊 俊 丁家望 楊超君 曾 萍

(三峽大學心血管病研究所 三峽大學第一臨床醫(yī)學院心內(nèi)科，湖北 宜昌 443003)

目的構(gòu)建含miR-24基因的重組腺病毒，為后期研究miR-24在大鼠頸動脈球囊損傷所致血管再狹窄(RS)中的作用及分子機制奠定基礎。方法PCR釣取目的基因miR-24，連接入穿梭載體GV139。采用AdMax腺病毒包裝系統(tǒng)，將構(gòu)建的miR-24重組腺病毒穿梭質(zhì)粒與輔助包裝質(zhì)粒(PBHG)共轉(zhuǎn)染HEK293細胞，通過Cre/loxP重組酶系統(tǒng)的作用實現(xiàn)重組，得到重組腺病毒，并進行重組腺病毒擴增、純化及滴度測定。結(jié)果成功構(gòu)建了大鼠miR-24腺病毒載體，滴度為1×109PFU/ml。結(jié)論成功獲得含miR-24基因的重組腺病毒，為后期順利開展有關miR-24在血管RS中的作用及分子機制研究提供了可能。

miR-24；腺病毒；載體；頸動脈；球囊損傷；再狹窄

miRs是一類高度保守的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，22～25個核苷酸。其通過與靶基因3’端非翻譯區(qū)(3’-UTR)互補配對結(jié)合，使靶mRNA降解或翻譯抑制，從而來調(diào)節(jié)細胞增殖、分化和凋亡等一系列生理進程〔1〕。研究表明不同血管特異性miRs 如miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-19b-1、miR-205、miR-92a、miR-145等通過調(diào)節(jié)各自的靶mRNA，參與調(diào)控損傷血管再狹窄(RS)的病理生理過程或者發(fā)揮保護效應〔2～5〕。miR-24在機體內(nèi)含量的改變與病理性血管新生內(nèi)膜的形成有著密切的關系〔6〕。但有關miR-24在血管RS這一病理過程中的作用及其調(diào)控機制鮮見報道。本研究旨在通過miR-24腺病毒載體的構(gòu)建、鑒定，腺病毒的包裝、擴增、純化等實驗過程，獲得具有一定滴度含miR-24基因的重組腺病毒，為后期研究miR-24在血管損傷所致RS中的作用及分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1大鼠miR-24穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 應用Primer5.0引物設計軟件設計含AgeⅠ和EcoRⅠ雙酶切位點的引物，該引物同時含有目的基因5’端部分序列用于PCR釣取目的基因，引物序列正義鏈：5′-AGGTCGACTCTAGAGGATCCGAAATCTTGAATGCAGTAGGC-3′，反義鏈：5′-GGAGGGAGAGGGGCGGATCCCTCTGCACTCTATTCAATG-3′。PCR反應條件：98℃ 5 min；98℃ 10 s；55℃ 10 s；72℃ 30 s；30個循環(huán)；72℃ 8 min。對釣取的目的基因產(chǎn)物進行AgeⅠ和EcoRⅠ雙酶切。用AgeⅠ和EcoRⅠ雙酶切腺病毒載體GV139以使其線性化，并與同樣被酶切的目的基因進行連接。將連接好的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，對長出的克隆進行酶切鑒定和測序比對。

1.2腺病毒載體的包裝 本實驗用質(zhì)粒抽提試劑盒提取構(gòu)建的miR-24穿梭質(zhì)粒DNA和輔助包裝質(zhì)粒pBHG loxΔE 1,3 Cre DNA，將提取的質(zhì)粒DNA 溶于除菌的TE緩沖液中，且保證A260/A280在1.8～2.0。將制備的質(zhì)粒DNA 5 μg加入一滅菌的離心管中并用DMEM混合均勻(共50 μl)，在室溫下溫育5 min。另取10 μl脂質(zhì)體2000試劑與50 μl DMEM 混合，同樣室溫下溫育5 min。把上述兩種稀釋液進行混合，在室溫下溫育20 min，形成轉(zhuǎn)染復合物。將轉(zhuǎn)染復合物轉(zhuǎn)染至人胚腎293細胞培養(yǎng)液中混勻、培養(yǎng)。6 h后倒去培養(yǎng)液，加入含10% 血清的細胞培養(yǎng)液5 ml，繼續(xù)培養(yǎng)。顯微鏡下觀察，若細胞出現(xiàn)病變、脫壁等現(xiàn)象，提示包裝成功。收集上清液(粗提液)，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3重組腺病毒的擴增和純化及滴度測定 第1輪擴增：將人胚腎293細胞傳入T25細胞培養(yǎng)瓶中，待60%融合時，棄去舊培養(yǎng)液，向培養(yǎng)瓶中加入粗提液2 ml，于培養(yǎng)箱中孵育90 min，最后再補加完全培養(yǎng)液3 ml并繼續(xù)培養(yǎng)。待出現(xiàn)典型的細胞病變、細胞脫壁時，收集病毒上清液于-70℃保存。第2輪擴增：將人胚腎293 細胞傳入T25 細胞培養(yǎng)瓶中，待90%融合時，棄去舊培養(yǎng)液，加入首輪擴增的病毒液2 ml，置于培養(yǎng)箱中孵育90 min，最后補加完全培養(yǎng)液10 ml并繼續(xù)培養(yǎng)。待出現(xiàn)典型的細胞病變、細胞脫壁時，收集病毒上清液于-70℃保存。將第2輪擴增的病毒上清液按相關步驟進行純化〔7〕，并感染人胚腎293細胞，以終點稀釋法計算滴度值。

2 結(jié) 果

2.1陽性克隆的鑒定與測序 PCR釣取的目的基因miR-24經(jīng)過交換、經(jīng)轉(zhuǎn)化后，行菌落PCR的鑒定，其結(jié)果與預期相符。重組陽性克隆測序，序列全部測通，miR-24穿梭質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2腺病毒載體包裝的結(jié)果 miR-24穿梭質(zhì)粒和腺病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人胚腎293細胞大約10 d后，觀測到細胞出現(xiàn)典型的細胞病變，提示腺病毒包裝成功。

2.3重組腺病毒擴增和純化及滴度測定的結(jié)果 兩輪擴增時，大部分細胞都出現(xiàn)了典型的細胞病變及脫壁現(xiàn)象。對病毒濃縮液滴度測定，顯示病毒滴度為1×109PFU/ml。

3 討 論

介入治療、冠脈搭橋手術是冠心病目前主要的治療方式〔8〕。然而，冠脈支架術后限制了其遠期療效，藥物涂層支架也沒有從根本意義上消除RS〔9〕。目前認為RS 形成原因有：擴張的球囊對血管壁的直接損傷；多種炎癥因子、細胞生長因子的釋放；原癌基因的異常表達和調(diào)節(jié)細胞周期的蛋白質(zhì)合成〔10〕。miRs廣泛存在于真核細胞中，能通過降解靶mRNA或抑制其翻譯，調(diào)節(jié)細胞增殖、分化與凋亡〔11〕。研究表明，機體內(nèi)miRs的改變與很多心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關，這其中就包含了冠脈支架術后RS〔12〕。但有關miR-24在血管RS這一病理過程中所起作用的報道并不多。若能弄清miR-24在RS中的作用及分子機制，將可能為冠脈支架術后RS的有效治療提供新思路。腺病毒可感染分裂和非分裂細胞，具有轉(zhuǎn)基因效率高、病毒滴度高、安全性好、外源性基因目的蛋白表達水平高、病毒基因組不整合宿主染色體等多項優(yōu)點，成為目前最具前景的載體之一〔13〕。

1van Rooij E.The art of microRNA research〔J〕.Circ Res,2011;108(2):219-34.

2Ling S,Nanhwan M,Qian J,etal.Modulation of microRNAs in hypertension-induced arterial remodeling through the β1 and β3-adrenoreceptor pathways〔J〕.J Mol Cell Cardiol,2013;65(12):127-36.

3Kaluza D,Kroll J,Gesierich S,etal.Histone deacetylase 9 promotes angiogenesis by targeting the antiangiogenic microRNA-17-92 cluster in endothelial cells〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol,2013;33(3):533-43.

4Rippe C,Blimline M,Magerko KA,etal.MicroRNA changes in human arterial endothelial cells with senescence:relation to apoptosis,eNOS and inflammation〔J〕.Exp Gerontol,2012;47(1):45-51.

5Rangrez AY,Massy ZA,Metzinger-Le Meuth V,etal.miR-143 and miR-145:molecular keys to switch the phenotype of vascular smooth muscle cells〔J〕.Circ Cardiovasc Genet,2011;4(2):197-205.

6Ji R,Cheng Y,Yue J,etal.MicroRNA expression signature and antisense-mediated depletion reveal an essential role of MicroRNA in vascular neointimal lesion formation〔J〕.Circ Res,2007;100(11):1579-88.

7范致星，楊 簡，楊 俊,等.大鼠微小RNA-22腺病毒載體的構(gòu)建和鑒定〔J〕.中華老年心腦血管病雜志,2014;16(8):853-5.

8Mavromatis K,Samady H,King SB.Revascularization in patients with diabetes:PCI or CABG or none at all〔J〕.Curr Cardiol Rep,2015;17(3):565.

9Costa MA,Simon DL.Molecular basis of restenosis and drug-eluting stents〔J〕.Circulation,2005;111(17):2257-73.

10Curcio A,Torella D,Indolfi C.Mechanisms of smooth muscle cell proliferation and endothelial regeneration after vascular injury and stenting:approach to therapy〔J〕.Circ J,2011;75(6):1287-96.

11He L,Hannon GJ.MicroRNAs:small RNAs with a big role in gene regulation〔J〕.Nat Rev Genet,2004;5(7):522-31.

12Fan ZX,Yang J.Microribonucleic acids and vascular restenosis〔J〕.Saudi Med J,2014;35(8):796-801.

13Ganeshan DM,Bhosale P,Munden RF,etal.Diaphragmatic hernia after esophagectomy for esophageal malignancy〔J〕.J Thorac Imaging,2013;28(5):308-14.

〔2016-06-24修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

國家自然科學基金資助項目(No.81170133，81200088，81470387)；三峽大學碩士學位論文培優(yōu)基金(No.2015PY052)

楊 簡(1982-)，男，博士，副主任醫(yī)師，碩士生導師，主要從事心血管疾病臨床及基礎研究。

R714.252

A

1005-9202(2017)17-4175-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.003