通過生化和蛋白組學分析探究應激標記

李岑岑（譯）

（華中農業大學農業部重點實驗室，湖北 武漢 430070）

通過生化和蛋白組學分析探究應激標記

李岑岑（譯）

（華中農業大學農業部重點實驗室，湖北 武漢 430070）

薦語：隨著全球畜牧業發展和國際貿易自由化、規范化進程加快，動物福利越來越受到關注，故客觀評估動物的福利水平至關重要。然而，目前的研究大多局限于基于動物表型以檢測動物的福利水平，而評估動物福利水平的實驗室生物標記信息很少，本文對不同飼養密度下母豬的應激進行了生化與蛋白組學分析，以期獲得一套客觀且易于檢測的實驗室參數用于動物福利的評估。

1 研究背景

妊娠期間母豬通常被安置于單個畜欄，這樣母豬易于管理，其群體應激減少，且易飼喂。然而，福利專家認為這種單獨的飼養系統會對動物產生應激，對動物是有害的，因此，歐盟已經禁止這種做法。妊娠母豬的限位欄飼養使其活動空間有限，容易發生皮膚擦傷、行動困難、肌肉質量下降和骨抗壓力喪失等現象。此外，相比于群養的母豬，單獨飼養的母豬更容易發生異常的行為和繁殖問題。

盡管客觀評估應激很重要，但是其實驗室生物標記的信息很少，有些文章已經評估了基于動物表型的有效性以檢測母豬的福利。如假裝咀嚼或過度飲水的行為表明單獨飼養的母豬在單個畜欄有所不適。不過我們也觀察到相反的結果，雖然限位欄飼養的母豬其打斗行為和假咀嚼行為很容易發生，但是群居母豬的飲水頻率要比單畜欄飼養的母豬高。

因此，獲得一套客觀且易于檢測的實驗室參數作為福利評分將是檢測動物福利的一個重要因素。動物行為、生物化學、生理學和免疫學的互補性以及現代高通量技術的使用有助于為動物的飼養和管理創造更全面的科學基礎。

我們小組以前的研究已經定義了潛在的實驗室標記來評估不同飼養密度下公豬的應激。我們的第一個研究目的是評估飼養環境變化后母豬的代謝和激素標志物，我們對急性期反應（AP）和氧化應激通路相關的蛋白也進行了分析。第二個研究目的是拓展2D-DIGE和iTRAQ標記蛋白組學技術的應用空間以尋找新的應激相關的血清標記。

2 方法

2.1 試驗設計

試驗材料為6月齡的后備母豬（長白×大白×杜洛克）60頭，10頭為一組。后備母豬被轉移到單畜欄的第1天隨意進食，每個畜欄大約飼喂2.5 kg的飼料。試驗豬只分為兩組，一組是HS組（n=15）在1 d（D1）、3 d（D3）、4 d（D4）、5 d（D5）對其進行采樣（樣品數為15乘4是60），該組母豬主要受到單畜欄飼養和重復取樣兩種應激；H組包括3個亞單位組，在3 d（n=15）、4 d（n=15）或5 d（n=15）對其進行采樣（樣品數為15乘3是45），接受單畜欄飼養和非重復取樣兩種應激，因此參與后期分析的樣品數為105。這種設計使我們能區別重復取樣和單畜欄飼養所產生的應激，不會干擾全進全出的管理模式。本試驗設計中，第1天測量的參數對應于基礎水平。

2.2 樣本采集和準備

上午9點到11點通過頸靜脈穿刺采取后備母豬的血樣，并放在無抗凝血劑（血清）或含有EDTA-K3（細胞裂解物和脫蛋白血液）的管中。2 000 r/min離心10 min獲得血清，離心后制備紅細胞裂解液，用0.9%的NaCl洗滌細胞沉淀，用冷凍的去離子水裂解。將血液和5%偏磷酸混合，然后3 000 r/min離心5 min獲取脫蛋白血液。通過使用小母豬自發咀嚼棉簽30～60 s收集唾液樣品，將棉簽4 000 r/min離心10 min。所有離心均在室溫下進行，將上清液冷凍在-80 ℃保存，直至分析。

2.3 參數分析

血清非酯化脂肪酸（NEFAs）、甘油三酯和膽固醇被確定為脂質代謝的標志物。血清總蛋白、尿素和肌酐被確定為蛋白質代謝的指標。用分析儀Olympus AU400測量代謝參數。所有的參數分析都進行重復分析。

2.4 免疫印跡

通過印跡法檢測羰基蛋白質含量，通過免疫印跡檢測血清載脂蛋白A-I（Apo A-I）。在兩種免疫測定中使用對照樣品來比較來自不同膜的結果。計算樣品和對照蛋白條帶之間的比率。

2.5 蛋白組學分析

通過2D-DIGE和iTRAQ對D1、D3和D5的血清樣品混合進行發現蛋白質組學研究。

2.6 生化數據的統計分析

所有統計分析使用SAS系統V.9.1.3（SAS Institute，Cary，NC，USA）進行。對于所有生化分析，使用個體豬作為試驗單位。當未指定時，顯著性水平（α）設定為0.05。沒有進行剔除異常值的測試。包括在統計分析中的變量是連續的。Shapiro-Wilk和Levene檢驗分別用于評價變量分布的正態性和方差齊性。選擇非參數（Wilcoxon檢驗）來比較在D1（基礎水平）和H和HS組的其余天數之間的所有測量參數獲得的結果。使用H和HS組之間的非參數（Wilcoxon檢驗）進行重復取樣對參數的影響。

3 結果

3.1 一般生化分析

結果顯示：兩組中在D3都觀察到非酯化脂肪酸（NEFA）瞬時增加，在D4迅速恢復正常水平；在研究結束時甘油三酯（TG）顯著增加；總膽固醇除了在HS組中D3增加之外，在其他時期沒有變化；除了H組D5觀察到較低水平的NEFA，在HS和H組之間沒有觀察到任何脂質標志物的差異。兩組的尿素在D4和D5下降。兩組中的肌酸酐在D3均增加，僅在H組D4和D5增加。在D3和D4轉換到單畜欄后，血清總蛋白濃度增加。HS和H組之間沒有差異。在血清中測量肌酸激酶（CK）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）和堿性磷酸酶（ALP）酶活性并作為肌肉（CK和ALT）或肝損傷（ALT和ALP）的標志物。發現CK和ALT活性在個體間的變異很大。在HS組中觀察到CK在D3增加。在血清和唾液中測定皮質醇作為應激標志物。該參數具有較大的個體間變異性，特別是在唾液中。

3.2 先天免疫系統和氧化應激防御監控

整個研究中H和HS組豬急性期反應蛋白水平發生變化，觸珠蛋白（Hp）在D3稍微增加并且隨后恢復到正常水平。C-反應蛋白（CRP）僅在HS組中D3增加，而在相同動物組中Apo A-I僅在D3處降低。H組和HS組改變飼養環境后氧化應激標記物發生了不同的變化：在H組中，谷胱甘肽過氧化物酶活性（GPx）在D4增加，超氧化物歧化酶（SOD）在D5增加，在tGSH和蛋白質-羰基中觀察到輕微增加。HS和H組之間僅在D4和D5觀察到GPx存在顯著的差異，在D5觀察到SOD存在顯著差異。

3.3 蛋白組學分析

通過2D-DIGE和iTRAQ分析蛋白質組變化。結果表明：在H和HS組的D3和D5存在差異表達。

3.4 2D-DIGE

在H和HS組中的D3發現Hp，α1抗胰凝乳蛋白酶3和PRDX2顯著增加，而Apo A-I顯著降低。所有四種蛋白質在D5漸漸恢復到基礎水平。

3.5 iTRAQ

8重iTRAQ分析鑒定了262種蛋白質。數據的總體分析反映了釋放到血流中的細胞內蛋白質的輕微增加和許多細胞外蛋白質的相對減少（基因本體分析，數據未顯示）。為了抵消這種蛋白質偏倚，對iTRAQ數據進行標準化。

在D3有67個蛋白減少，54個蛋白增加。大多數蛋白質在HS組中顯示比H組更大的倍數變化，并且在D3比在D5產生更大的倍數變化。

在差異表達的蛋白質中，其中有兩個蛋白在2D-DIGE分析也得到了：在D3和D5發現ApoA-I減少并且PRDX2增加。還通過iTRAQ鑒定了其他功能相關蛋白，例如載脂蛋白C-III，E，M和R（脂質轉運）和谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）同種型3（抗氧化防御）。另一組具有相關功能的差異表達的蛋白質與免疫系統相關，包括乳鐵蛋白，protegrin 3和半乳凝素1，其在H組和HS組中在D3增加，并且在D5恢復基礎水平。最后，另一個相關的蛋白質組是細胞內蛋白質，如肌動蛋白結合蛋白，微管蛋白，參與糖酵解的酶和幾個蛋白酶體亞基，這些蛋白在血清中水平增加。

4 討論

在所有樣品（樣品數=105）中進行詳細的生物化學分析，并且進行兩種蛋白質組學方法用于鑒定該應激條件的新的潛在標記物。

生化分析表明小母豬在試驗過程中是健康的。NEFA水平表明D3脂肪的脂質水平增加，而研究結束時兩個動物組中的TG的增加表明后備母豬適應新的環境并且標準化它們的食物攝入。在蛋白質組學分析中也觀察到脂質代謝的變化。這些觀察結果證實改變的脂質代謝與生理應激相關，可能是受腎上腺素和皮質醇的脂解活性的結果。

應激，日糧的改變也可能會加速母豬蛋白質的分解代謝。由于血液提取過程中組織損傷可能會導致HS組骨骼肌標記CK增加。骨骼肌中含有豐富的CK和ALT，這兩種物質之間存在強相關性（r=0.785）。關于氧化應激，H組的小母豬比HS組的小母豬具有更高的抗氧化活性。重復采血可能通過減少抗氧化劑防御或提高活性氧（ROS）來增加HS小母豬的氧化應激程度。

兩種不同的蛋白質組學方法，表明HS組中的蛋白質組成比H組中的發生更大的變化，證明反復取樣和居住環境/飲食改變的后備母豬會受到更大的挑戰。

蛋白質組學還表明發生了一定程度的細胞損傷，導致血漿中細胞蛋白質的相對增加，例如肌動蛋白結合蛋白、微管蛋白、參與糖酵解的酶和幾個蛋白酶體亞基。這些蛋白質中有些是潛在的優秀標記物，因為它們在血清中大量增加。由于單畜欄會減小空間，進而引起相關的物理損傷，可以增加細胞滲漏。有趣的是，已經報道過細胞質蛋白β-肌動蛋白是圈養中的應激生物標志物。然而，只有在更多數量的個體和不同的應激條件下對這些蛋白進行徹底的驗證，才能被認為是足夠的生物標志物。

在所有情況下（生化標記物和蛋白質組學結果），在H和HS組中觀察到的血清分析變化發生相同的變化。HS組中所有的變化總是比H組的變化大，更加說明在受到兩種類型的應激后后備母豬損傷更重要。

需要進一步的研究以確認差異表達的蛋白可以作為應激生物標志物，并表征其特異性，敏感性和代謝動力學。

5 結論

母豬飼養于單畜欄會促進其血清組成的相關變化，包括脂質、蛋白質分解代謝和氧化應激的增加，先天免疫系統的激活，可能引起組織損傷。因此，我們建議將血漿脂質標志物、APP或其他先天免疫指標、氧化還原成分、細胞內蛋白質和唾液皮質醇的綜合信息作為豬福利的評判指標。

（原文作者及鏈接：Anna Marco-Ramell,Laura Arroyo,Raquel Pe a,Raquel Pato,Yolanda Saco,Lorenzo Fraile,Em ke Bendixen and Anna Bassols；http://bmcvetres. biomedcentral.com/articles/10.1186/s12917-016-0887-1）

2017-01-16）