豬IGF2基因多態性研究

武建亮，徐 利，盧紀和，孟慶利，馬小軍，周海深，王麗麗

（北京養豬育種中心，北京 100194）

豬IGF2基因多態性研究

武建亮，徐 利，盧紀和，孟慶利，馬小軍，周海深，王麗麗

（北京養豬育種中心，北京 100194）

該研究分析了豬胰島素樣生長因子2（IGF2）基因內含子3的3 072位點在大白、長白、杜洛克3個品種中的多態性，并分析不同基因型與100 kg體重日齡和背膘厚的關系。結果表明，在3個品種中均存在A、G基因型，且A基因型為優勢基因型。3個品種中A基因型個體背膘厚顯著低于G基因型個體（P＜0.05），而不同基因型間100 kg體重日齡無顯著差異。結果提示IGF2可作為脂肪沉積的候選基因應用于標記輔助選擇。

豬；IGF2基因；多態性；背膘厚

胰島素樣生長因子2基因（Insulinlike Growth Factor-2，IGF2），是最早發現的內源性印跡基因，其表達、調控不遵循孟德爾遺傳規律。IGF2是一種多功能細胞增殖調控因子，對細胞的分化、增殖、胚胎的生長發育具有重要作用。IGF2是一種促細胞分裂多肽，也被稱為生長調節素A，參與生長激素發揮作用，刺激培養細胞生長，在哺乳動物的生長發育過程中起著重要作用。有研究表明，在歐洲野公豬與大白豬的雜交后代以及皮特蘭與大白豬的雜交后代中存在一個影響豬肌肉生長和脂肪沉積的QTL，為父源表達，并定位在豬2號染色體短臂末端IGF2基因座上[1-4]。近來發現，IGF2基因內含子3的3 072位點的G→A單堿基突變正好位于高度保守的調控區域，影響豬骨胳中IGF2的表達，并且對出生后的肌肉形成起重要作用，該G→A突變與瘦肉率存在相關性，使得豬瘦肉量增加3%～4%[5]。許多研究結果發現，IGF2基因還與豬的初生重、生長速度、背膘厚、瘦肉率等重要經濟性狀相關[6-8]。本研究以大白、長白、杜洛克為研究對象，分析IGF2基因不同基因型與生長速度、背膘厚的關系，旨在為豬生長和肉質性狀標記輔助選擇提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

在北京養豬育種中心的下屬豬場采集了大白、長白、杜洛克3個品種共600頭母豬的耳組織，放入75%的酒精中于-20 ℃保存。同時收集豬只的背膘厚和100 kg體重日齡等生長性狀相關指標數據。DNA提取試劑盒、PCR相關試劑、內切酶、Marker、瓊脂糖、TAE緩沖液等購自TAKARA公司。

1.2 DNA提取

按照DNAiso Reagent試劑盒說明書提取DNA，-20 ℃保存。

1.3 PCR反應

根據GenBank中檢索到的豬IGF2基因（序列號：AY242109）DNA序列，用Primer 3.0軟件在IGF2 intron3 G3072A位點附近設計引物。IGF2引物序列：F-5’-CGGACCGAGCCAGGGACGA-3’；R-5’-GCCGGCTGGAAGGGAGGAA-3’。

IGF2基因PCR擴增采用的25 μL反應體系為：2×Taq PCR Mastermix 12.5 μL，引物各0.5 μL(10 μM)，DNA 1.0 μL和水。PCR擴增的反應條件： 94 ℃變性4 min，35次循環(94 ℃，30 s；54.5 ℃，30 s；72 ℃，30 s)，72 ℃延伸5 min。

1.4 多態性檢測

PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后直接測序，序列通過MEGA v4.0軟件進行比對，確定檢測個體IGF2的基因型。

1.5 數據分析

100 kg體重日齡和背膘厚指豬只在85～135 kg范圍內實際稱重并用ALOKA 500型B超儀測量的倒數第三、第四肋骨間的背膘厚，根據《全國種豬遺傳評估方案（試行）》提供的校正公式校正后的100 kg體重日齡和背膘厚。

IGF2第三內含子3 072位點不同基因型對背膘厚和100 kg體重日齡的影響用SPSS 17.0軟件中的一般線性模型（GLM）進行統計分析，GLM為：

2 結果與分析

2.1IGF2基因多態性檢測及基因型頻率

根據序列比對結果，在所檢測的個體中在IGF2基因第三內含子3 072位點存在A和G兩種基因型。根據IGF2基因不同基因型在各品種中的檢出個數，計算其基因型頻率，結果見表1。

表1 IGF2第三內含子3 072位點不同基因型頻率

2.2IGF2第三內含子3 072位點不同基因型與背膘厚的關系

IGF2第三內含子3 072位點不同基因型對背膘厚的影響見表2。IGF2第三內含子3 072位點不同基因型的背膘厚在大白、長白和杜洛克3個品種中均表現為G型顯著高于A型（P＜0.05）。就同一基因型而言，大白和長白、長白和杜洛克間均無顯著差異，大白和杜洛克間差異顯著（P＜0.05）。

表2 IGF2第三內含子3 072位點不同基因型對背膘厚的影響 mm

2.3IGF2第三內含子3 072位點不同基因型與100 kg體重日齡的關系

IGF2第三內含子3 072位點不同基因型對100 kg體重日齡的影響見表3。IGF-2第三內含子3 072位點不同基因型的100 kg體重日齡在大白、長白和杜洛克3個品種中均無顯著差異。就IGF2第三內含子3 072位點同一基因而言，大白和長白豬間的100 kg體重日齡差異不顯著，杜洛克與其他兩個品種的100 kg體重日齡差異顯著（P＜0.05）。

表3 IGF2第三內含子3 072位點不同基因型對100 kg體重日齡的影響 d

2.4 豬100 kg體重日齡和背膘厚的差異性分析

豬100 kg體重日齡和背膘厚在不同品種、IGF-2不同基因型之間存在一定的差異，該研究通過建立一般線性模型進行方差分析剖析了差異的來源，結果見表4。建立的一般線性模型對于豬不同品種、IGF-2不同基因型之間的100 kg體重日齡和背膘厚的分析是適宜的（P＜0.01），其校正的R2統計量分別為0.012和0.131，品種差異顯著（P＜0.05），IGF2不同基因型對豬100 kg體重日齡沒有顯著效應，而對背膘厚有顯著效應（P＜0.05）。說明豬背膘厚的差異主要來源于不同基因型和品種的差異。

表4 豬100 kg體重日齡和背膘厚的差異性分析

3 討論

3.1IGF2基因多態性分析

IGF2基因多態性研究已經成為豬育種實踐應用中關注的焦點。Knoll等[9]通過連鎖分析，確定了豬IGF2基因內含子2中有G→A轉換的單核苷酸多態性，這一轉換導致了NciⅠ限制性酶切位點的改變。有研究進一步分析了這一單核苷酸多態性在長白、大白、杜洛克豬和皮特蘭4個品種中的分布情況[2，10]。劉桂蘭等[11]對大白×梅山豬F2代資源家系群體的IGF2基因第8內含子的研究中，發現兩個等位基因頻率差異較大的NciⅠ酶切位點。薛慧良等[12]對豬IGF2基因外顯子8進行了PCR-SSCP檢測，發現單核苷酸C→T轉換。有研究發現豬IGF2基因內含子3的3 072位點的存在G→A單堿基突變[5]。本研究在大白、長白和杜洛克3個品種中發現在第3內含子3 072位點均存在A和G兩種基因型，且A等位基因為優勢等位基因。這一結果與虞德兵等[13]、Yang等[14]分析這一多態性在長白、大白、長×大雜交豬及二花臉等中國地方品種中的分布情況相符，即A等位基因在長白和大白豬群體中為優勢等位基因。

3.2IGF2基因多態性與100 kg體重日齡的關系

本研究結果表明IGF2第3內含子G3 072A多態性在大白、長白和杜洛克3個品種的100 kg體重日齡均無顯著相關。而林長光等[7]研究表明大白和長白豬中該位點AA基因型個體比GA和GG基因型個體生長速度快，等位基因A對豬的生長具有正效應。Kolaríková等[10]對大白豬群體IGF2基因內含子2的研究結果表明，不同基因型對日增重無顯著相關性。而薛慧良等[12]、Magri等[15]和Grrard[16]等的研究表明在IGF2基因外顯子8上檢測到的多態性位點基因型間初生重差異顯著。

3.3IGF2基因多態性與背膘厚的關系

在諸多研究中均表明IGF2基因中不同位點的多態性與豬的背膘厚、瘦肉率等肉質性狀存在相關性。如IGF2基因內含子8上NciI多態性位點的不同基因型間脂肪沉積和瘦肉量存在差異顯著[11]。IGF2基因內含子7上多態性位點的基因型間背膘厚及瘦肉率有著顯著差異顯著[17]。IGF2基因外顯子8上檢測到的多態性位點不同基因型間6月齡背膘厚的差異顯著[12]。IGF2基因內含子3的3 072位點G→A多態性與豬瘦肉率存在相關性，A型個體的瘦肉率比G型個體高3%～4%[5]。同時有研究表明這一變異對梅山×歐洲白豬雜交后代個體的背膘厚有顯著影響[18]。相關研究還表明A基因型個體的在臀部、胸腰部和第6～7肋處的膘厚比G型個體要薄[13]。本研究分析表明IGF-2基因第3內含子G3 072A多態性與在大白、長白、杜洛克3個品種的背膘厚間存在顯著差異，且A基因型個體背膘厚顯著低于G基因型個體，這與Laere等、Jungerius等、虞德兵等研究結果相一致。表明在選種、育種實踐過程中，IGF2基因可作為脂肪沉積的候選基因應用于標記輔助選擇，選擇帶有A等位基因的個體有望降低后代的背膘厚、提高胴體瘦肉率，改善豬肉品質，加快育種進程。

[1] JEON J T，CARLBORG ，T RNSTEN A，et al.A paternally expressed QTL affecting skeletal and cardiac muscle mass in pigs maps to the IGF2 locus[J].Nature genetics，1999，21(2)：157-158.

[2] NEZER C，MOREAU L，BROUWERS B，et al.An imprinted QTL with major effect on muscle mass and fat deposition maps to the IGF2 locus in pigs[J].Nature Genetics，1999，21(2)：155—156.

[3] ANDERSSON L，HALEY CS，ELLEGREN H，et al.Genetic mapping of quantitative trait loci for growth and fatness in pigs[J].Science，1994，263(5154)：1771—1774.

[4] ALEXANDER L J，TROYER D L，ROHRER G A，et al.Physical assignments of 68 porcine cosmid and lambda clones containing polymorphic microsatellites[J].Mammalian Genome，1996，7(5)：368-372.

[5] V A N L A E R E A S，N G U Y E N M，BRAUNSCHWEIG M，et al.A regulatory mutation in IGF2 causes a major QTL effect on muscle growth in the pig[J].Nature，2003，425(6960)：832—836.

[6] 孫億，費思清，唐輝，等.豬IGF2基因G3072A位點多態性及其與大白豬初生重和早期生長的關系[J].畜牧獸醫學報，2007，38(12)：1306-1310.

[7] 林長光，劉亞軒，吳悌霖，等.IGF2基因多態性檢測與生長性狀相關性分析[J].福建農林大學學報（自然科學版），2011，40(6)：624-627.

[8] STINCKENS A，MATHUR P，JANSSENS S，et al.Indirect effect of IGF2 intron3 g.3072G＞ A mutation on prolificacy in sows[J].Animal genetics，2010，41(5)：493-498.

[9] KNOLL A，PUTNOVA L，DVO K J，et al.A Ncii PCR RFLP within intron 2 of the porcine insulin like growth factor 2b (IGF2) gene[J].Animal genetics，2000，31(2)： 150.

[10] KOLA KOV O，PUTNOV L，URBAN T，et al.Associations of the IGF2 gene with growth and meat efficiency in Large White pigs[J].J.Appl.Genet，2003，4(44)：509-513.

[11] 劉桂蘭，蔣思文，熊遠著，等.IGF2基因PCR-RFLP多態性與脂肪沉積相關性狀的關聯分析[J].遺傳學報，2003，30(12)：1107—1112.

[12] 薛慧良，徐來祥，XUEHui-Liang，等.豬IGF2基因的遺傳多態性及其遺傳效應分析[J].遺傳，2008，30(2)：179-184.

[13] 虞德兵，何宗亮，張偉峰，等.豬IGF2基因內含子3變異的遺傳效應分析[J].遺傳，2008，30(1)：87-93.

[14] YANG G C，REN J，GUO Y M，et al.Genetic evidence for the origin of an IGF2 quantitative trait nucleotide in Chinese pigs[J].Animal genetics，2006，37(2)： 179-180.

[15] MAGRI K A，BENEDICT M R，EWTON D Z，et al.Negative feedback regulation of insulin-like growth factor-II gene expression in differentiating myoblasts in vitro[J].Endocrinology，1994，135(1)：53-62.

[16] Gerrard D E，Okamura C S，Ranalletta M A，et al.Developmental expression and location of IGF-I and IGFII mRNA and protein in skeletal muscle[J].Journal of Animal Science，1998，76(4)：1004-1011.

[17] VYKOUKALOVA Z，KNOLL A，DVO K J，et al.New SNPs in the IGF2 gene and association between this gene and backfat thickness and lean meat content in Large White pigs[J].Journal of Animal Breeding and Genetics，2006，123(3)：204-207.

[18] JUNGERIUS B J，VAN LAERE A S，TE PAS M F W，et al.The IGF2-intron3-G3072A substitution explains a major imprinted QTL effect on backfat thickness in a Meishan×European white pig intercross[J].Genetical research，2004，84(2)：95-101.

2016-12-26）

北京三元種業科技股份有限公司自立課題，課題編號：SYZYZ20130015

武建亮，男，博士，從事種豬生產與管理工作，E-mail：wwwjl1617@163.com