影響體外鼠胚試驗標準化的要素分析

史建峰，韓倩倩，王春仁

(中國食品藥品檢定研究院,醫療器械檢定所,生物材料室，北京 102629)

影響體外鼠胚試驗標準化的要素分析

史建峰，韓倩倩*，王春仁*

(中國食品藥品檢定研究院,醫療器械檢定所,生物材料室，北京 102629)

不孕癥已成為影響人類生殖健康的全球性問題，作為治療不孕癥的一種重要治療手段，輔助生殖技術經過幾十年的發展已經獲得長足進步。輔助生殖技術用醫療器械產業快速發展，對此類產品進行風險管理，制定相應的安全性評價檢測方法已勢在必行。2016年行業標準YY/T 1434-2016《人類體外輔助生殖技術用醫療器械體外鼠胚試驗》已經發布，本文就體外鼠胚試驗中的關鍵節點和試驗體系要素進行簡要綜述。

輔助生殖技術；體外鼠胚試驗；2-細胞阻滯；醫療器械

1 引言

生態環境惡化、生活節奏加快和工作壓力增加導致不孕癥的發病率升高，已成為全球性問題，在發展中國家尤為突出。我國不孕癥的發病率約為15%，數千萬患者飽受疾病困擾，并由此衍生出更深層的社會問題。人類生殖健康問題催生體外輔助生殖技術，自第一例試管嬰兒誕生至今，輔助生殖技術已獲得長足進步，應用日益廣泛，尤其在發達國家，應用輔助生殖技術出生的嬰兒占年度總出生人口的1%以上。同時，輔助生殖技術用醫療器械市場也得到快速發展，產品種類、產業規模和臨床使用量均呈逐年上漲的趨勢，對輔助生殖技術用醫療器械的風險管理應予以高度重視。

2 輔助生殖技術及相關醫療器械

1978年Robert Edwards利用體外受精-胚胎移植技術(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)培育了世界上第一個試管嬰兒[1]，為不孕癥患者帶來福音。IVF-ET是輔助生殖技術(assisted reproductive technology，ART)中的一種，ART是指通過對精子、卵子、受精卵和胚胎進行操作處理，治療不孕不育的技術。除了IVF-ET，ART還包括卵子體外成熟(in vitro maturation，IVM)、人工授精(artificial insemination，AI)、胞漿內單精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)、精子和胚胎凍融和移植前遺傳學診斷等技術。

細胞生物學技術帶動ART不斷發展完善的同時，輔助生殖技術用醫療器械也在迅速發展。輔助生殖技術用醫療器械主要包括手術類器械如取卵針、培養皿、胚胎移植導管等器具耗材類產品和與精子、卵子、受精卵和胚胎接觸的操作液、緩沖液、洗滌液、培養液、保存液和冷凍液等液體類產品。輔助生殖技術用醫療器械中的液體類產品與配子和合子接觸時間較長，應用種類繁多，在風險等級較高的產品中液體類產品居多。目前國內的液體類產品主要以進口為主，取得注冊證的進口液體類產品均按照風險等級最高的三類醫療器械進行管理。

3 輔助生殖用醫療器械的安全性評價

輔助生殖技術的核心環節是用人工手段使卵子和精子結合成受精卵，待發育成8-細胞早期胚胎后移入子宮繼續發育直至分娩。早期胚胎的質量是保證胚胎移植成功和胎兒健康的關鍵，因此對相關輔助生殖用醫療器械進行風險管理必不可少，建立有效的安全性評價檢測方法也勢在必行。2016年1月國家食品藥品監督管理總局頒布了YY/T 1434-2016《人類體外輔助生殖技術用醫療器械體外鼠胚試驗》行業標準，為輔助生殖技術用醫療器械的監管提供了有力的技術支持。

4 體外鼠胚試驗

4.1 體外鼠胚試驗

體外鼠胚試驗是指在體外培養體系中，使小鼠的受精卵培養發育到囊胚的過程，主要包括性腺激素促進卵子超排、交配合籠、受精卵采集和體外培養以及囊胚形成率檢測幾個步驟。1956年Whitten成功使小鼠8-細胞胚胎在體外培養發育成囊胚[2]，McLaren和Biggers將體外培養得到的囊胚移植入雌鼠子宮獲得成體小鼠[3]，小鼠早期胚胎體外培養-胚胎移植入母體妊娠-成體小鼠分娩整個試驗體系基本建立，為人類輔助生殖技術的發展提供了科學依據。

4.2 2-細胞阻滯

在大量的科學試驗中，人們發現大多數近交系和封閉群小鼠的受精卵體外培養經過第一次分裂后就出現發育停滯，不再繼續分裂發育成囊胚，這種現象稱為2-細胞阻滯。Whitten和Biggers證明2-細胞阻滯是由雌鼠的基因型決定的[4]。與近交系和封閉群小鼠相比，近交系雜交F1代小鼠通過2-細胞阻滯能力大大增強，如B6D2F1、B6AF1和B6D1F1等，而近交系和封閉群雜交的小鼠也會發生2-細胞阻滯，如SJL/L，126/Br和DBA等[4，5]。將非阻滯小鼠胚胎細胞質轉移到阻滯小鼠后可以順利通過2-細胞阻滯，但是將非阻滯小鼠處于G1期的1-細胞細胞質注射給阻滯品系卻不能通過2-細胞阻滯[6]，提示在這一階段通過2-細胞阻滯所需的因子沒有表達，而將非阻滯小鼠處于G1和G2期(非S期)的2-細胞的細胞質可以幫助阻滯小鼠通過2-細胞阻滯[7]。而在體內經過一次分裂得到的2-細胞可以在體外培養條件下順利發育成囊胚，并且在體外發生阻滯的2-細胞轉入到含輸卵管組織塊中，能夠繼續分裂發育[8]，有研究證實輸卵管可以提供受精卵發育到囊胚所需的激素、生長因子和抗氧化物質[9]。這些結果提示2-細胞阻滯不僅受機體因素影響，也受到培養環境的調控。

4.3 幾種常見的小鼠胚胎培養液

在BMOC2之后，科研人員對培養基進行了多次改良衍生出多種培養基，目前常用的有M16、CZB和KSOM三種。上世紀70年代M16培養基配制成功，通過試驗證明，M16可以支持幾種近交系小鼠(如C3H)和雜交F1代(如B6D2F1)發育形成囊胚，而很多近交系小鼠在M16中會發生2-細胞阻滯。為能使受小鼠胚胎通過2-細胞阻滯，CZB培養基和KSOM培養基應運而生其應用效果也得到證實[10，11]。培養液的主要能量底物是丙酮酸、乳酸和葡萄糖。丙酮酸是早期卵裂期的主要能量來源[12-14]；乳酸能夠支持2細胞階段后的胚胎發育并且培養基中乳酸鹽可以影響丙酮酸鹽的代謝[15]；葡萄糖則為致密化期的主要供能物[16]，CZB培養基在4-細胞后加入葡萄糖成分，KSOM降低了葡萄糖的濃度，當葡萄糖濃度升高時，非阻滯小鼠會發生2-細胞阻滯現象[17]。將鏈脲霉素誘導的糖尿病雌鼠的受精卵和胚胎移植分別給正常假孕雌鼠妊娠14.5 d后發現胚胎神經管畸形率顯著上升，而將正常小鼠2-細胞在體外高濃度葡萄糖環境下培養至囊胚再移植給正常小鼠發現胚胎畸形率沒有上升但是吸收胎和移植成功率卻顯著下降[18]。

4.4 影響小鼠胚胎體外培養的因素

4.4.1 氧含量

培養環境的氧含量對早期胚胎發育有重要調控作用，大氣中氧氣的濃度為21%左右，而哺乳動物細胞中氧含量卻為2% ～ 8%，已有研究證實在相對比5%氧濃度的培養環境，20%氧濃度的環境下哺乳動物囊胚形成率和質量都顯著下降[19，20]，高濃度氧導致胚胎發育延遲及對胚胎發育的副作用是積累性的，產生的副作用是不可逆的，在人的胚胎體外培養也得到類似的結果[21，22]。在高氧環境下加入抗氧化劑后，小鼠胚胎的發育情況可以得到改善[23]。有研究證明高氧環境對卵子發育也有負調控作用[24]。培養基中的氧可以影響胚胎對碳水化合物和氨基酸的代謝，并且在致密化前、后階段表現出相反的調節作用，在致密化前，高氧環境下胚胎糖酵解和氨基酸代謝水平升高，而致密化后反而降低[25，26]，提示胚胎發育不僅受營養成分影響還受到營養代謝方式的影響。高氧濃度可以調控受精卵-囊胚階段基因的表達和甲基化[27-29]，并且誘導移植前胚胎細胞衰老標志表達和DNA損傷導致細胞周期停滯[30]。

4.4.2 氨基酸

氨基酸在小鼠早期胚胎發育中也發揮重要作用，受精卵在添加Eagles非必需氨基酸的培養基中，囊胚形成率、細胞數和孵化率都顯著提升[31]。研究表明在培養體系中加入甘氨酸可以調節滲透壓從而促進MII 卵細胞的細胞質成熟進而促進胚胎的體外發育[32]。但是氨基酸經過代謝產生的銨鹽對胚胎發育是不利的，當培養基中的銨鹽濃度達到75 μmol/L就會對胚胎產生毒性作用，也會影響胚胎發育的關鍵基因的表達[33]。作為培養液中的營養成分，谷氨酰胺的代謝是銨鹽的主要來源，科學家為降低銨鹽的濃度，對谷氨酰胺進行修飾，發現銨鹽的產生很難完全避免，培養基換液可以有效緩解銨鹽對胚胎的毒性作用，研究表明高氧濃度對銨鹽的產生也有促進作用[34]。

4.4.3 滲透壓

滲透壓對小鼠胚胎發育有重要調節作用，輸卵管中的滲透壓為290 ～ 310 mOsM[35，36]，CZB和KSOM培養基降低了無機鹽濃度，使動物對滲透壓敏感性降低，當滲透壓升高時，非阻滯小鼠也會發生阻滯現象[17]，有報道證明滲透壓對胚胎發育的阻滯效應主要是使2-細胞不能進入M期[37]。石蠟油也是胚胎體外培養所需的材料，小鼠從1-細胞到檢測囊胚形成率所需時間為96 h，石蠟油可以防止培養液蒸發帶來的滲透壓、pH和溫度對培養發育的副作用[38]，但是石蠟油對胚胎有一定的毒性[39]。

4.5 培養方法的選擇

哺乳動物胚胎早期體外培養有單一培養和共培養兩種方式，共培養是將兩種或兩種以上的細胞在同一環境下共同培養，通過細胞通訊和信號轉導等方式相互作用，支持生長的一種培養方式。前文提到將產生阻滯的2-細胞轉移至含輸卵管組織塊的培養基中可以通過2-細胞阻滯。有學者將多種體細胞共培養，建立更加接近體內微環境的培養體系可以促進昆明小鼠的胚胎發育[40]。在培養方式中可以選擇單一培養或序貫培養，序貫培養是根據胚胎發育到不同階段的不同營養需求，采用不同成分的培養基的培養方法。人類輔助生殖的培養基則更加細化，在配子、合子和囊胚期分別使用不同的培養基，可以有效提高胚胎移植成功率，已經被廣泛應用。

5 體外鼠胚試驗的標準化

體外鼠胚試驗受內因和外因共同作用，內因為小鼠遺傳背景，外因為培養體系和培養方法。在培養體系建立、培養成分調整、試驗儀器耗材改進和操作方法優化中，研究人員做了大量工作并取得很多成果，但是小鼠自身調節胚胎發育機制還有待更加深入的研究。2-細胞阻滯是體外鼠胚試驗的關鍵節點，直接影響試驗成敗，新的標準有1-細胞和2-細胞兩種方法可供選擇，其中后者受2-細胞阻滯的制約相對較小，但是對產品的檢驗工作應從實際出發，根據產品的預期用途、接觸部位和接觸時間合理評估風險并選擇適當的檢測方法。醫療器械的安全性評價要求試驗體系具備足夠的穩定性和敏感性，所以應結合試驗動物、培養體系、培養方法和陽性對照等因素綜合考慮。例如ICR雌鼠超排卵能力強，應用此品系小鼠可以減少實驗動物用量，但是ICR屬于阻滯系小鼠，對培養條件要求相對較高。雜交F1代小鼠抗阻滯能力較強，但其成本普遍較高。穩定的試驗體系是檢驗工作的基礎，而體系的敏感性是檢驗工作有效、可靠的保證。將近交系、封閉群和雜交F1代小鼠在不同的次優級培養環境下進行比較，發現封閉群小鼠相較其他兩者對環境的反應更加敏感[41]。體外鼠胚試驗的主要判定依據為囊胚形成率和囊胚質量，尤其是對囊胚質量的評價受檢驗人員經驗等主觀因素制約，進而研究人員在細化判定標準中做了更加深入的工作?，F在普遍認為在2-細胞后合子基因激活(zygotic gene activation，ZGA)，之后Pou5f和Cdx2在小鼠早期胚胎中發揮重要的調控作用，利用轉基因動物對關鍵基因進行標記并在體外培養中對基因表達水平進行檢測，在微觀層面去評價胚胎發育是否受到影響[42]。物種間對培養環境的敏感性有一定差異，有研究發現小鼠受精卵在體外優化培養體系和較差培養環境下獲得胚胎與在體內環境培養或是含輸卵管組織塊培養環境下獲得胚胎相比，在移植成功率方面沒有顯著差異[43]，因此陽性物足夠敏感，與產品相適應也是非常必要的。

6 總結

輔助生殖技術用醫療器械應用于配子-合子-胚胎-胚胎移植的各個階段，產品創新和產業升級都要求產品安全、有效性評價工作與時俱進，與產業發展相適應。建立穩定可靠的評價方法，對現有標準進行改進和延展，為監管工作提供技術支持，助推行業發展是醫療器械檢驗工作從業人員的奮斗目標。

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Analysis of factors affecting the standardization ofinvitromouse embryo test

SHI Jian-feng, HAN Qian-qian*, WANG Chun-ren*

(Department of Biomaterials, Institute of Medical Device Verification, National Institutes for Food And DrugControl, Beijing 102629, China)

Infertility has become a global problem affecting human reproductive health. As an important treatment for infertility, assisted reproductive technology has made great progress over the past few decades. Rapid development has also taken place in medical devices for human assisted reproductive technology. It is imperative to establish the risk management and safety evaluation system of these products. In 2016, the industry standard YY/T 1434-2016 “HumaninvitroAssisted Reproductive Technology With Medical EquipmentinvitroMouse Embryo Test” was officially released. In this paper, the key notes and elements of thisinvitromouse embryo test are briefly reviewed.

Assisted reproductive technology;Invitromouse embryo assay; 2-cell block; Medical devices

史建峰，男，(1986-)，碩士，主要從事醫療器械生物學檢驗工作。Email: shengwushi@163.com

王春仁，男，教授，研究領域為醫用生物材料和組織工程方面的安全性評價。Email: chunrenwang@263.net; 韓倩倩，女，副研究員，研究領域為高風險生物材料和醫療器械的生物學評價。*共同通訊

研究進展

R-33

A

1671-7856(2017) 07-0102-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.07.019

2017-02-08