幽門螺桿菌感染小鼠慢性胃炎模型的建立及評(píng)價(jià)

連大衛(wèi)，扶麗君，許藝飛，任文康，操紅纓，黃 萍

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣州 510405)

幽門螺桿菌感染小鼠慢性胃炎模型的建立及評(píng)價(jià)

連大衛(wèi)，扶麗君，許藝飛，任文康，操紅纓，黃 萍*

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣州 510405)

目的 建立幽門螺桿菌(H.pylori)感染動(dòng)物模型，評(píng)價(jià)H.pylori相關(guān)慢性胃炎胃黏膜病理變化。方法 灌胃H.pyloriSS1菌株建立在體感染，感染后第2周后采用快速尿素酶法和PCR法檢測感染成功率；確認(rèn)感染成功后再分別繼續(xù)飼養(yǎng)至6周和12周，建立H.pylori相關(guān)慢性胃炎動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取胃腺體組織別進(jìn)行HE和硼酸美蘭染色，分析胃炎程度及H.pylori感染程度；生化法檢測胃組織中髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，丙二醛(malondialdehyde，MDA)和過氧化氫酶(catalase，CAT)的含量變化；RT-qPCR法檢測胃組織中COX-2、iNOS、TNF-α和IL-1β基因表達(dá)的變化。結(jié)果 與正常組相比，模型6周和12周組胃組織內(nèi)可見H.pylori定植，并且黏膜層有不同程度的慢性炎性細(xì)胞浸潤，腺體萎縮和腸化生情況；同時(shí)組織中CAT和SOD的含量明顯下降，MPO和MDA的水平和COX-2、iNOS、TNF-α和IL-1β基因表達(dá)均有顯著上升(P< 0.05 或P< 0.01)。結(jié)論通過灌胃給菌的方法可以成功將H.pylori定植于小鼠體內(nèi)，并在定植的6周和12周后均可引起慢性炎性細(xì)胞的浸潤，并使增強(qiáng)胃腺體組織內(nèi)氧化應(yīng)激水平和促炎基因的表達(dá)，但12周模型感染程度更深，出現(xiàn)腺體萎縮和腸化生的情況。

幽門螺桿菌；慢性胃炎；小鼠模型；氧化應(yīng)激；促炎因子

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，H.pylori)是一種常見的人體感染細(xì)菌，屬于彎曲桿狀微需氧的革蘭陰性菌，全球有一半以上的人口感染[1]，我國H.pylori的感染率在60%左右[2]。近年國內(nèi)外對H.pylori是慢性胃炎、消化性潰瘍和胃腺癌發(fā)生的主要誘導(dǎo)因素達(dá)成共識(shí)，并已被世界衛(wèi)生組織列為I類致癌因子[3，4]。因此建立H.pylori感染的慢性胃炎動(dòng)物模型對于探討其致病機(jī)理、評(píng)估藥物療效和驗(yàn)證治療方案等研究具有重要意義。H.pylori感染小鼠模型在近些年的研究中最為廣泛[5，6]，本研究旨在通過建立不同的感染時(shí)間對模型動(dòng)物體內(nèi)胃炎的發(fā)展進(jìn)行比較評(píng)分，并分析其胃組織內(nèi)氧化應(yīng)激水平與促炎因子的表達(dá)，探討不同感染時(shí)間形成的胃炎程度與其病理機(jī)制，為優(yōu)化模型奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)菌

C57BL/6小鼠，34只，SPF級(jí)雄性，5 ～ 6周齡，體重17 ～ 18 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2012-0001】，動(dòng)物運(yùn)輸前抽取部分小鼠進(jìn)行胃部PCR檢測，確認(rèn)小鼠未感染鼠源性幽門螺桿菌。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)(大學(xué)城)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SYXK(粵)2013-0085】，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。H.pylori(SS1)由澳大利亞莫納什大學(xué)Richard Ferrero教授饋贈(zèng)。

1.2 儀器和試劑

Campylobacter agar base(Oxoid，批號(hào)1589242)；Brain-heart unfusion(Oxoid，批號(hào)1677862)；革蘭氏染色液試劑盒(海博生物，批號(hào)HB8278)；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(天根生物，批號(hào)DP302-2)； Super Real Pre Mix × Plus(天根生物，批號(hào)03120)；FastQuant RT Kit(天根生物，批號(hào)03326)；Trizol Reagent(Thermo Life Technology，批號(hào)28218)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天，批號(hào)P0010S)；超氧化物歧化酶檢測試劑盒(南京建成，批號(hào)20160306)；髓過氧化物酶檢測試劑盒(南京建成，批號(hào)20160302)；丙二醛檢測試劑盒(南京建成，批號(hào)20160304)；過氧化氫酶檢測試劑盒(南京建成，批號(hào)20160309)；麥?zhǔn)媳葷醿x(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)； NU-5831E三氣培養(yǎng)箱(Nuaire)；HVE-50高溫滅菌鍋(Hirayama)；生物安全柜(ESCO)；倒置顯微鏡(Olympus)；BioSpec-nano核酸分析儀(島京)；CFX 96(Bio-Rad)；低溫高速離心機(jī)(Eppendorf)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)菌培養(yǎng)與鑒定

(1)幽門螺桿菌的復(fù)蘇和傳代

將凍存的H.pylori菌株從超低溫冰箱(-80℃)取出，復(fù)蘇于彎曲桿菌瓊脂培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，含7%脫纖維新鮮羊血及聯(lián)合抗生素(萬古霉素10 mg/L，甲氧芐氨嘧啶 5 mg/L、頭孢磺啶 5 mg/L、兩性霉素 5 mg/L)的平板上。倒置平板置于37℃，5%O2，10%CO2，85%N2的培養(yǎng)箱中復(fù)蘇48 ～ 72 h。待細(xì)菌長滿平板后，使用一次性無菌棉簽刮取并重懸于的PBS中接種于新的培養(yǎng)基上，再生長48 ～ 72 h。

(2)幽門螺桿菌菌株的鑒定

使用一次性接種環(huán)取部分細(xì)菌，在載玻片上涂布均勻，酒精燈烤干片。使用革蘭染色試劑盒染色細(xì)菌，在顯微鏡下使用油鏡觀察細(xì)菌形態(tài)。同時(shí)取少量菌液置于快速脲素酶試劑里，1 min后觀察試劑顏色變化。

1.3.2 造模方法及感染檢測

(1)動(dòng)物分組

C57BL/6小鼠，34只雄性，隨機(jī)分為空白對照組10只及感染組24只。感染組經(jīng)口服H.pylori確認(rèn)感染成功后，再隨機(jī)分為模型6周對照組、模型12周對照組，每組8只。

(2)幽門螺桿菌感染方法

將經(jīng)過鑒定取傳至第二代的H.pylori(SS1)菌株，加入10%FBS的BHI培養(yǎng)液中調(diào)節(jié)成麥?zhǔn)蠞舛葹?.1的菌液，放入37℃微需氧環(huán)境下(5%O2、10%CO2和 85%N2，濕度95%)，120 rpm搖床上震蕩培養(yǎng)16 ～ 18 h，使得H.pylori生長至對數(shù)生長期。取出菌液，0.25 mL只灌胃感染組小鼠，共灌胃3次，隔天一次，每次灌胃幽門螺桿菌前禁食12 h，灌胃完成后2 h后進(jìn)食。感染組小鼠于給予2%的鹽水直至開始給藥，以增強(qiáng)細(xì)菌感染力。

(3)幽門螺桿菌感染檢測方法

灌胃感染結(jié)束后一周，隨機(jī)取8只感染組小鼠及2只空白對照組小鼠做感染檢測，以確定H.pylori在動(dòng)物體內(nèi)感染定植。檢測前小鼠禁食24 h，小鼠處死后，使用滅菌的手術(shù)器械，取出胃組織，沿胃大彎剪開胃部，使用無菌的PBS沖洗胃部殘?jiān)Ｈ∥赶俨侩S機(jī)分為2份，一份剪下后置于快速尿素酶試劑內(nèi)；一份液氮急凍用于PCR檢測。置于快速尿素酶試劑內(nèi)胃腺部組織在37℃烘箱內(nèi)孵育6 h，顏色變?yōu)榧t色表明感染成功。取另一份胃腺體組織，依據(jù)細(xì)菌DNA提取試劑盒說明書操作提取DNA。使用引物16s，擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性2 min，94℃解鏈2 s，53℃退火2 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)。配置1.5%瓊脂糖凝膠，100 V，35 min，5 μL上樣量，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測。擴(kuò)增產(chǎn)物目的長度為375 bp。引物設(shè)計(jì)結(jié)果見表1。

表1 引物序列Tab.1 Sequences of primers

1.3.3 病理學(xué)檢測

飼養(yǎng)結(jié)束后，脫頸椎處死動(dòng)物，采用無菌無酶處理后的手術(shù)器械剖腹取胃，沿胃大彎剪開，用生理鹽水洗去胃內(nèi)容物，沿胃小彎剪取從胃竇到胃體組織，分為3份，兩份置于4%多聚甲醛中固定，分別做HE染色觀察胃炎程度和硼砂美蘭染色觀察幽門螺桿菌感染狀況并參考文獻(xiàn)評(píng)分[7]；另一份液氮中速凍，后移至-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 組織內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的測定

取出凍存組織，勻漿后再4℃， 12000 g離心5 min取上清液，分別參照MPO、SOD、 MDA和CAT檢測試劑盒方法進(jìn)行檢測。

1.3.5 組織內(nèi)促炎因子基因表達(dá)水平的測定

胃組織中總RNA提取及cDNA合成：參照TRIzol說明書方法提取胃組織的總RNA，在超紫外分光光度儀上測D(λ)260 nm/280 nm比值達(dá)到1.8 ～ 2.0后，按逆轉(zhuǎn)入試劑盒操作方法得到cDNA。引物設(shè)計(jì)結(jié)果見表1。實(shí)時(shí)熒光定量RT-qPCR擴(kuò)增程序用熒光定量檢測試劑盒，在Bio-Rad熒光定量PCR儀上擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃延伸60 s，40個(gè)循環(huán)。分析結(jié)果，得出各組內(nèi)參基因和目的基因Ct值，運(yùn)用2-△△Ct公式計(jì)算。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 幽門螺桿菌感染檢測結(jié)果

感染組動(dòng)物胃腺體組織快速尿素酶試劑檢測為紅色，同時(shí)其PCR擴(kuò)增可以得到長度為375 bp的16s產(chǎn)物。綜上結(jié)果顯示幽門螺桿菌成功在體感染，見圖1。

注：A：快速尿素酶法檢測H.pylori感染(左側(cè)2管為空白對照組，RUT為陰性，顯黃色；右側(cè)8管 為感染組，RUT為陽性，顯紅色)；B：PCR檢測H. pylori感染。圖1 幽門螺桿菌鑒定結(jié)果Note. A: Rapid urease test of H. polyri infection. Left two tubes: yellow, control group, represent negative reaction. Right 8 tubes: red, infected group, RUT-positive. B: PCR identification of H. pylori infection.Fig.1 Identification of H. polyri

2.2 幽門螺桿菌感染模型病理切片結(jié)果

相比正常組，模型組6周的胃粘膜層顯示出現(xiàn)單核細(xì)胞密集和浸潤的慢性胃炎病理學(xué)變化，同時(shí)可見H.pylori感染，屬于H.pylori相關(guān)慢性胃炎的階段；模型組12周的胃粘膜層不僅表現(xiàn)出慢性炎癥和H.pylori感染，而且出現(xiàn)了胃固有腺體減少，被炎性細(xì)胞取代，纖維組織增加的情況，屬于H.pylori相關(guān)萎縮性胃炎；模型組6周和12周的胃黏膜層均少見中性粒細(xì)胞浸潤，見圖2、表2 ～ 6。

例數(shù)(n)慢性胃炎程度Degreesofchronicinflammation0123 P正常組Controlgroup87100模型組(6周)Infectedgroup，6weeks81700<001模型組(12周)Infectedgroup，12weeks81610<001

注：分?jǐn)?shù)：無，0；輕度，1；中度，2；重度，3。

Note.Scores: normal, 0; mild, 1; moderate, 2; severe, 3.

表3 H. pylori感染小鼠胃組織切片活動(dòng)性炎癥程度Tab.3 Degrees of active inflammation in the gastric tissues of H. pylori-infected mice

注：分?jǐn)?shù)：無，0；輕度，1；中度，2；重度，3。

Note. Scores: normal, 0; mild, 1; moderate, 2; severe, 3.

表4 H. pylori感染小鼠胃組織切片萎縮程度Tab.4 Degrees of glandular atrophy in the gastric tissues of H. pylori-infected mice

注：分?jǐn)?shù)：無，0；輕度，1；中度，2；重度，3。

Note. Scores: normal, 0; mild, 1; moderate, 2; severe, 3.

表5 H. pylori感染小鼠胃組織切片腸化生程度Tab.5 Degrees of intestinal metaplasia in the gastric tissues of H. pylori-infected mice

注：分?jǐn)?shù)：無，0；輕度，1；中度，2；重度，3。

Note. Scores: normal, 0; mild, 1; moderate, 2; severe, 3.

表6 H. pylori感染小鼠胃組織切片細(xì)菌定植程度Tab.6 Degrees of bacterial colonization in the gastric tissues of H. pylori-infected mice

注：分?jǐn)?shù)：無，0；輕度，1；中度，2；重度，3。

Note. Scores: normal, 0; mild, 1; moderate, 2; severe, 3.

2.3 幽門螺桿菌感染模型胃組織中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)表達(dá)結(jié)果

與正常組相比，模型組小鼠胃組織中CAT和SOD含量均有不同程度的下降；MPO和MDA含量均有顯著上升，其中模型12周增加程度高于模型6周，見表7。

表7 H. pylori感染小鼠胃組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)的表達(dá)Tab.7 Levels of oxidative stress indicators in the gastric tissues of H. pylori-infected mice

注：與正常對照組比較，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01；與模型6周組比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note. Compared with the control group,ΔP<0. 05,ΔΔP< 0.01; Compared with the model of 6-week infected group,*P< 0.05,**P< 0.01.

表8 H. pylori感染小鼠胃組織中相關(guān)促炎因子表達(dá)Tab.8 Expression levels of pro-inflammatory factors in the gastric tissues of H. pylori-infected mice

注：與正常對照組比較，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01；與模型6周組比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note. Compared with the control group,ΔP< 0. 05,ΔΔP< 0.01; Compared with the model of 6-week infected group,*P< 0.05,**P< 0.01.

2.4 幽門螺桿菌感染模型胃組織中相關(guān)促炎因子表達(dá)結(jié)果

與正常組相比，模型組小鼠胃組織中COX-2、iNOS、TNF-α、IL-1β的基因表達(dá)均明顯上升，其中模型12周促炎因子表達(dá)高于模型6周。見表8。

3 討論

H.pylori(Sydney strain 1，SS1)是Lee等人從C57BL/6小鼠體內(nèi)分離而出[8]，具有高致病性的致病島(pathogenicity island)基因，能編碼IV型分泌系統(tǒng)(T4SS)和毒素相關(guān)蛋白A(cytotoxin-associated protein A，CagA)，同時(shí)空泡毒素A(vacuolating cytotoxin A，VacA)表達(dá)也呈現(xiàn)陽性，足以導(dǎo)致宿主細(xì)胞在增殖，骨架重排，細(xì)胞連接，形態(tài)延伸與散射等方面的改變，破壞胃上皮細(xì)胞。此外，H.pylori感染還會(huì)通過與宿主免疫系統(tǒng)相互作用而激活免疫應(yīng)答，招募而來的炎性細(xì)胞不僅會(huì)釋放的促炎因子加劇局部炎癥程度，而且會(huì)累積大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)和活性氮(reactive nitrogen species，RNS)[9，10]，原本這些活性物質(zhì)具有清除外來微生物的作用，但H.pylori具備逃逸清除的功能，因此氧化應(yīng)激生成的活性物質(zhì)不僅無法殺滅細(xì)菌，反而破壞了機(jī)體自身系統(tǒng)的平衡并造成炎癥等多種應(yīng)激損傷，是導(dǎo)致最終相關(guān)胃炎發(fā)生的重要因素。

H.pylori在體感染的難點(diǎn)是需要有在體適應(yīng)能力強(qiáng)的H.pylori菌株，本實(shí)驗(yàn)使用的菌株由澳大利亞莫納什大學(xué)的Richard Ferrero教授饋贈(zèng)，從C57BL/6小鼠在體分離出來之后體外共傳5代的H.pylori(SS1)，細(xì)菌灌胃前在液體環(huán)境中培養(yǎng)16 ～ 18 h使其進(jìn)入對生長數(shù)期，并讓動(dòng)物禁食4 ～ 12 h，灌胃完成后再禁食1 ～2 h便于H.pylori定植。除了細(xì)菌因素以外，作為實(shí)驗(yàn)感染對象的小鼠也需要嚴(yán)格的質(zhì)量控制，鼠源性H.pylori在小鼠種群內(nèi)的傳染性極強(qiáng)，而被鼠源性H.pylori感染的小鼠不僅難以接種上SS1菌株，而且也無法保證實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)一性，因此在實(shí)驗(yàn)前先使用PCR技術(shù)確定購置的小鼠胃部沒有H.pylori感染也尤為重要。與此同時(shí)，造模期間給予2%的鹽水也能增加H.pylori的定植成功率[11]。國內(nèi)外文獻(xiàn)中，雖有應(yīng)用C57BL/6小鼠成功建立H.pylori相關(guān)胃炎模型的報(bào)道，但對于其病理機(jī)制探討較少。本次實(shí)驗(yàn)不僅證明模型小鼠在感染6周后會(huì)出現(xiàn)慢性胃炎，感染12周后出現(xiàn)萎縮性胃炎；而且其胃組織中MDA、MPO的含量和COX-2、iNOS、TNF-α、IL-1β基因的表達(dá)均顯著上升，SOD和CAT含量顯著下降，并伴隨著H.pylori定植時(shí)間的延長而加重；說明模型小鼠胃組織中促炎因子的表達(dá)不斷增加，氧化-抗氧化平衡體統(tǒng)被打破，局部氧化應(yīng)激程度持續(xù)加劇，最終表現(xiàn)出更嚴(yán)重的炎癥損傷，推動(dòng)H.pylori感染相關(guān)慢性胃炎的發(fā)展。本次實(shí)驗(yàn)所采用的動(dòng)物造模方法成功率高，并探討了模型的致病機(jī)理，為實(shí)驗(yàn)的重復(fù)以及進(jìn)一步深人研究提供了基礎(chǔ)。

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·專家問答·

問：大鼠腦脊液抽取方法

答：采集大鼠腦脊液可參考的方法有經(jīng)皮穿刺延髓池抽取腦脊液法、直視下劃破硬脊膜抽取腦脊液法和直視下微量進(jìn)樣器經(jīng)硬脊膜穿刺抽取腦脊液法。方法一，是在非直視下操作，故要求操作者熟悉大鼠頭頸部解剖結(jié)構(gòu)，精確掌握進(jìn)針點(diǎn)、角度與深度，并根據(jù)個(gè)體差異調(diào)整手法。方法二，簡單方便，對操作者技術(shù)要求低，但是割破硬脊膜易造成腦脊液流失和少量的血污染，因此采集量以及采集效率會(huì)受影響。方法三，效果最佳，成功率可達(dá)100%，且污染率最低。方法要點(diǎn)：麻醉、固定大鼠，剪去背毛，兩耳根的連線處剪開一橫切口，中點(diǎn)縱向剪開，將皮分離用止血鉗拉向兩側(cè)。緊貼大鼠顱底用鑷子和止血鉗逐層鈍性分離各層肌肉，暴露出枕骨大孔。手持100 μL微量進(jìn)樣器，針尖斜面向上，與水平面呈20 ～ 30度角刺入枕骨大孔，進(jìn)針深度大約2 ～ 3 mm。剛刺入時(shí)會(huì)有強(qiáng)烈的突破感，此時(shí)即可得到少許腦脊液，待固定針體后，繼續(xù)緩慢抽取，采集量可達(dá)100 μL。

(感謝中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所 張麗 的解答)

Establishment and evaluation of a mouse model of chronicgastritis induced byHelicobacterpylori

LIAN Da-wei, FU Li-jun, XU Yi-fei, REN Wen-kang, CAO Hong-ying, HUANG Ping*

(School of Chinese Meteria Medica, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, China)

Objective To establish a mouse model ofH.pyloriinfection, and to evaluate the chronic pathological changes in the gastric mucosa associated withH.pyloriinfection. Methods 34 male 5～6-week old SPF C57BL/6 mice were used in this study. The mice were intragastrically administrated with a suspension ofH.pyloriSS1 strain. Two weeks after infection, rapid urease test and PCR were performed to confirm theH.pyloriinfection. Successfully infected mice were randomly divided into 3 groups including the control group, 6-week and 12-week infected groups. Samples of gastric mucosa were taken for pathological analysis using HE and borax methylene blue staining. The contents of myeloperoxidase (MPO), superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA) and catalase (CAT) in the gastric tissues were detected by biochemistry, and the expression levels ofCOX-2,iNOS,TNF-αandIL-1βwere examined by RT-qPCR. Results Compared with the control group,H.pyloricolonization was observed in the gastric mucosa of the 6-week and 12-week infected mice, with chronic inflammatory cell infiltration, glandular atrophy and intestinal metaplasia to varying extents. The contents of CAT and SOD were significantly decreased, while the levels of MPO and malonaldehyde MDA, and the expression levels ofCOX-2，iNOS，TNF-αandIL-1βwere significantly increased (P<0.05 orP<0.01). Conclusions Intragastric administration withH.pyloriin C57BL/6 mice can be successfully used to generate the bacterial colonization, leading to chronic inflammatory cell infiltration, enhanced oxidative stress, and up-regulated expression of proinflammatory genes in the gastric glandular tissues at 6 and 12 weeks after inoculation. However, the inflammatory changes are more extensive in the mice at 12 weeks after infection, with glandular atrophy and intestinal metaplasia.

Helicobacterpylori; Chronic gastritis; Mouse model; Oxidative stress; Proinflammatory factors

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：81374043)；廣東省科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(編號(hào)：2016A020217019)；廣州市科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(編號(hào)：201607010336);廣東省省級(jí)科技計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2013A022100001)。

連大衛(wèi)(1988-)，男，博士研究生，專業(yè)：中藥復(fù)方藥理。E-mail：675836257@qq.com

黃萍(1960-)，女，教授，研究方向：中藥新藥與保健品開發(fā)。E-mail：hping331@126.com

研究報(bào)告

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A

1671-7856(2017) 07-0006-07

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.07.002

2016-11-29