DB11/T828.3-2011中12號染色體標記篩選及適用性評價研究

魏 杰，王 洪，于鵬麗，岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

DB11/T828.3-2011中12號染色體標記篩選及適用性評價研究

魏 杰，王 洪，于鵬麗，岳秉飛*

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

目的 對北京小型豬遺傳質量控制地方標準DB11/T828.3-2011中空缺的12號染色體標記進行篩選，并通過比較不同標記對同種群的遺傳評價對地標的適用性進行分析。方法 結合文獻報道，選取12號染色體上的4對微衛星標記，利用2個中國農大小型豬群體進行篩選；選取高度多態的12號染色體標記合并標準方法的18對染色體標記，形成全染色體法，通過不同方法對同批次群體的遺傳質量評價進行比較分析。所得結果均使用Popgen32軟件處理分析。結果 篩選到的4對12號染色體標記PIC值均大于0.5，為高度多態；現行標準在染色體覆蓋率、擴增穩定性、結果評價三項指標結果分別為94.7%、96.0%、農大I系不合格而農大III系合格，增加12號染色體后評價的三項指標的結果分別為100%、96.6%和兩群體均合格。結論 本研究篩選的4對12號染色體標記具有高度多態性，為完善DB11/T828.3-2011提供數據支撐。

DB11/T828.3-2011；12號染色體；多態性；適用性；遺傳質量

實驗用小型豬由于體型小、易飼育、生理解剖與人高度相似等特性，其研發與應用已受到廣泛關注[1-3]。特別是隨著器官移植與人源化研究的不斷深入，小型豬資源更成為了人類健康的希望之光[4,5]。

我國小型豬資源豐富。長期以來，人們對不同品種品系小型豬在種資資源、遺傳結構、生物學特性及應用進行了相關研究，但對資源的標準化尤其是遺傳質量標準化研究尚在起步[6]。實驗動物的遺傳質量對醫學生物學研究的準確性、重復性及科學性有著至關重要的影響，而遺傳質量監測又是評價和保證動物資源質量的必要措施?；诖?，北京地區在2011年出臺了實驗用小型豬遺傳質量控制地方標準(北京市地方標準公告2011年標字第7號，總第109號)，并在2012年正式實施[7]。

在標準的研究過程中，研究樣本來自廣西巴馬小型豬、貴州小型豬、藏香豬和長春“軍牧1號”；而作為北京地標，對于北京地區的小型豬遺傳質量監測是否適用尚有待研究[6,8]。2013年，中國食品藥品檢定研究院應用DB11/T828.3-2011號標準對房山小型豬群體進行檢測時，發現了該地標中存在著12號染色體標記缺失等問題，而因此導致的對遺傳概貌反映不夠全面，是否影響遺傳質量評價也未可知[8]。為此，本研究利用北京地區兩個農大小型豬群體進行12號染色體微衛星標記篩選，并通過篩選到的高度多態位點與原標準中的25對微衛星標記形成全染色體標記法，比較其與標準方法在質量評價中的應用，為地標的不斷完善和小型豬的標準化進程提供技術資料。

1 材料和方法

1.1 樣本

按照DB11/T828.3-2011的要求，取封閉繁育4代以上、不同窩別的農大I系和農大III系小型豬樣本，每品系15頭，雌7頭雄8頭。樣品由北京市琉璃河科興實驗動物養殖中心提供【SCXK(京)2012-0005】。

1.2 樣本DNA的制備[8]

用改良酚-氯仿抽提法從血樣中提取基因組DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并用紫外分光光度計測定DNA的濃度及純度，-20℃凍存備用。

1.3 引物[7]

本研究所用25對引物均按照北京市地方標準對封閉群實驗用小型豬的規定，序列詳見DB11/T828.3-2011附錄B。12號染色體的4對引物標記S1060、SW168、SW467、SW2494，序列詳見美國農業部官網數據庫(http://www.marc.usda.gov/genome)。所有引物均由北京擎科新業生物技術有限公司合成。

1.4 主要試劑儀器、PCR擴增程序及結果處理均同已發文獻[9]

1.5 結果評價

12號染色體標記篩選中，當標記的平均多態信息含量(polymorphism information content，PIC)大于0.25，即中度多態，可作為備選標記與原標準方法形成新的全染色體標記檢測法。否則需要重新篩選，直到篩選到中度多態以上的標記。

DB11/T828.3-2011中的25對微衛星標記為標準方法。利用標準方法和全染色體標記法共同評價相同群體，通過兩者在遺傳質量評價中的差異比較分析標準方法的適用性。其中，對群體遺傳質量的評價，仍參照平均雜合度及卡方檢驗指標[7]。即當平均雜合度在0.5 ～ 0.7，且期望雜合度與觀測雜合度經卡方檢驗無明顯差異，可判定為為合格的封閉群實驗用小型豬群體，否則判為不合格。

2 結果

2.1 12號染色體微衛星標記的篩選

利用農大I系、農大III系小型豬群體的DNA進行標記篩選，通過等位基因頻率計算PIC數據。結果顯示，4對標記均有PIC>0.25。結果詳見表1。

2.2 全染色體標記法的建立及對兩群體小型豬的遺傳質量評價

新篩選到的4對12號染色體標記均為高度多態位點，合并地標中其余18對染色體的25對標記，共29對微衛星標記形成覆蓋19對染色體的全染色體法。利用新建方法對農大I系、農大III系小型豬群體進行測定，兩群體的平均雜合度分別為0.6062和0.6821，卡方檢驗P值分別為0.1390和0.7339(均大于0.05)。即通過全染色體標記法檢測，兩群體均為合格的封閉群小型豬群體。具體遺傳參數詳見表2、表3。

表1 12號染色體微衛星位點PIC數據表Tab.1 Polymorphism information content (PIC) of microsatellite loci in chromosome 12

表2 農大I系小型豬群體遺傳參數表(全染色體法)Tab.2 Genetic parameters of China Agricultural University miniature pig I (whole chromosome method)

表3 農大III系小型豬群體遺傳參數表(全染色體法)Tab.3 Genetic parameters of the China Agricultural University miniature pig III (whole chromosome method)

表4 標準方法與全染色體法的比較Tab.4 Comparison of the standard method with whole chromosome method

2.3 標準方法對相同兩群體的遺傳質量評價及與全染色體法的比較[9]

利用標準方法的25對標記對農大I系、農大III系相同群體樣本進行測定結果已另文發表。測定結果為：兩群體的平均雜合度分別為0.6759和0.6779，卡方檢驗P值分別為0.0022和0.7054。農大I系小型豬群體的觀測雜合度與期望雜合度存在差異(P< 0.05)即通過標準法檢測，農大III系小型豬群體可判定為合格的封閉群小型豬群體，農大I系不能判定為合格的封閉群小型豬群體。對兩種方法進行比較分析，發現兩者在染色體覆蓋率、擴增穩定性及結果評價上均存在差異，結果詳見表4。

3 討論與建議

3.1 篩選標記的多態性

多態信息含量(PIC)是用以反應基因座位多態性的指標[10]，用來評價標記位點是否可提供足夠的遺傳信息。當PIC>0.25時，為中度多態，可提供較為合理的遺傳信息；PIC>0.5時，可提供高度豐富的遺傳信息；而PIC<0.25時，則提供的遺傳信息較差。因此在標記的篩選中，需要通過PIC值選擇中高度多態性標記，從而提供足夠的遺傳信息。

本研究中，從數據庫中選擇的4對位點標記在國外豬種的研究中表現為中高度多態，而對于北京地區的小型豬是否適用需要通過研究驗證。為降低標記在地區間存在差異的影響與可能，初步選擇4對標記進行研究。結果4對標記在農大小型豬兩個群體中均表現為高度多態，可以用于遺傳質量評價。

3.2 對DB11/T828.3-2011技術方法的適用性評價與建議

DB11/T828.3-2011是國內第一部有具體技術方法的小型豬遺傳質量控制地方標準；同時作為北京地區第一批實驗動物標準，彌補了因無國家標準而無法在北京地區開展實驗用小型豬行政許可管理的空白。

地標中的25對微衛星標記分布于19對染色體中的18對上(缺少12號染色體標記)，基礎的染色體覆蓋率為94.74%(18/19)，反映的遺傳概貌不夠全面。因此在質量評價中就可能存在不夠全面客觀的情況。通過研究也發現，標準方法和全染色體法在質量評價上出現了差異，標準修訂時應考慮增加12號染色體標記。在擴增穩定性上，兩種方法均存在15號染色體標記未能穩定擴增，應當通過進一步研究確定是否為品系特征，加強位點標記方法的研究，進一步完善標準的技術方法，使其反映的結果更為科學，從而實現標準對資源應用的保障作用。

[1] 袁進, 顧為望. 小型豬作為人類疾病動物模型在生物醫學研究中的應用[J]. 動物醫學進展, 2011, 32(2): 108-111.

[2] 馮書堂, 李奎, 劉嵐, 等. 小型豬近交系新品種的培育與開發利用[J]. 農業生物技術學報, 2015, 23(2): 274-280.

[3] Ross JW, Fernandez de Castro JP, Zhao J, et al. Generation of an inbred miniature pig model of retinitis pigmentosa [J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2012, 53(1): 501-507.

[4] 劉廣波. 異種移植相關的豬內源性逆轉錄病毒的調查和實驗研究[D]. 廣州: 南方醫科大學, 2012.

[5] 潘登科, 馮沖, 王寧, 等. GalKO/hCD46的人源化五指山小型豬[Z]. 2012中國器官移植大會, 中國福建廈門, 2012.

[6] 吳艷花, 徐玲玲, 杜小燕, 等. 封閉群實驗用小型豬遺傳標準的建立[J]. 實驗動物科學, 2010, 27(6): 33-38.

[7] DB11/T828.3-2011. 實驗用小型豬 第3部分: 遺傳質量控制[S].

[8] 魏杰, 王洪, 李芳芳, 等. 房山封閉群小型豬微衛星位點的測定[J]. 中國比較醫學雜志, 2013, 23(11): 7-12.

[9] 魏杰, 鞏薇, 王洪, 等. 北京中國農大小型豬三個亞系群體的遺傳狀況分析[J]. 中國比較醫學雜志, 2016, 26(10): 50-55.

[10] Kunieda T, Kobayashi E, Tachibana M, et al. Polymorphic microsatellite loci of the rat (Rattusnorvegicus) [J]. Mamm Genome, 1992, 3(10): 564-567.

Screening of the makers of chromosome 12 and evaluate the applicability ofBeijing local standard DB11/T828.3-2011

WEI Jie， WANG Hong， YU Peng-li， YUE Bing-fei*

(National Institutes for Food And Drug Control, Beijing 100050, China)

Objective To screen the markers of chromosome 12, which is vacant in the Beijing local standard DB11/T828.3-2011 for genetic quality control of miniature pigs in Beijing, and to study the applicability of the local standard by comparison of two different methods for evaluation of the genetic quality of the same population. Methods According to the literature, we selected four pairs of microsatellite markers of chromosome 12 and studied the polymorphism through monitoring the genetic quality of two populations of China Agricultural University miniature pigs. We screened the highly polymorphic markers of chromosome 12, combined them with the microsatellite primers of the standard 18 pairs of chromosomes to establish the whole chromosome method. We compared and analyzed the applicability of the local standard DB11/T828.3-2011 through monitoring the genetic quality of the same population of miniature pigs with different method. The data were processed and analyzed using software Popgen32. Results All the screened four pairs of microsatellite markers of chromosome 12 were highly polymorphic (PIC>0.5). The local standard showed a chromosome coverage of 94.7%, stability of amplification of 96.0%, and certified that the China Agricultural University miniature pig III was qualified, while the China Agricultural University miniature pig I was not qualified. When the markers of chromosome 12 were added, the whole chromosome method showed result of 100% chromosome coverage and 96.6% amplification stability, both of the two populations of pigs were certified as qualified. Conclusions The four screened markers of chromosome 12 are all highly polymorphic, and provide a support for supplement of the local standard DB11/T828.3-2011.

Local standard DB11/T828.3-2011; Chromosome 12; Polymorphism; Applicability; Genetic quality

中國食品藥品檢定研究院中青年基金(2014C4)。

魏杰(1982-)，女，助理研究員，碩士。研究方向：免疫遺傳檢測。Email: jane3040320@163.com

岳秉飛(1960-)，男，研究員，博士。研究方向：動物遺傳學。Email: y6784@126.com

研究報告

R-33

A

1671-7856(2017) 07-0059-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.07.011

2016-12-30