冠心病血瘀證表觀遺傳學研究進展?

陳 光，高嘉良，劉詠梅，王 階△

(1. 中國中醫科學院廣安門醫院，北京 100053； 2. 北京中醫藥大學，北京 100029)

【綜述】

冠心病血瘀證表觀遺傳學研究進展?

陳 光1,2，高嘉良1，劉詠梅1，王 階1△

(1. 中國中醫科學院廣安門醫院，北京 100053； 2. 北京中醫藥大學，北京 100029)

從表觀遺傳學研究探討冠心病血瘀證的證候實質，主要包括DNA甲基化修飾和非編碼RNA調控兩個方面。DNA甲基化的調控方式具有整體、可逆、間接的特點，而非編碼RNA的調節方式具有廣泛、多樣、復雜的特點。總體而言，表觀遺傳學調控的時間特異性和組織特異性明顯，調節方式相對間接，充分體現基因遺傳與環境的相互作用，其中滲透著中醫天人相應、整體觀的思想，為研究中醫證候實質與中藥作用機制提供了合作平臺。

冠心病；血瘀證；表觀遺傳學；DNA甲基化；mircoRNA；綜述

血瘀證是中醫理論傳統證候的重要組成部分，是中醫臨床各科常見的一種證候，也是冠心病(coronary heart disease, CHD)最常見的證型之一。而表觀遺傳學是研究基因的核苷酸序列在不發生改變的情況下，基因表達的可遺傳變化，是后基因組時代生命科學領域的重要組成部分。隨著中醫藥現代化的進程，近年來一些學者從表觀遺傳學水平研究探討CHD血瘀證的證候實質，主要涉及DNA甲基化修飾、非編碼RNA(noncoding RNA, ncRNA)調控與組蛋白修飾[1]等層面，為研究中醫學證候本質提供了新的思路與方法，已成為目前研究的熱點，因此本文對其研究進展進行綜述。

1 DNA甲基化

1.1 甲基化研究基礎

在真核細胞中，甲基化是由甲基轉移酶(DNA methyltransferase, DNMT)的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將甲基主要轉移到CpG雙核苷酸序列的胞嘧啶第五位碳原子上。DNA甲基化修飾使DNA結合蛋白的部位，即DNA雙螺旋凹槽的外形發生改變，從而導致與DNA結合蛋白的結合能力降低[2]，從而調節轉錄。在方法學上，待測樣本的DNMT水平和甲基化CpG結合蛋白水平，分別對預測基因組甲基化水平和甲基化在調節轉錄方面發揮調節作用程度具有一定意義。從DNA甲基化水平研究中醫證候本質，主要存在以下特色及優勢。一是DNA甲基化本身是可逆的，并受環境因素改變的影響，這就使其在研究證候的時間特異性領域中占有一定的地位，并為中藥干預甲基化程度提供了可能性；二是在脊椎動物中甲基化CpG在整個基因組中均有分布，這為研究中醫藥干預證候機制的整體性提供了依據；三是DNA甲基化調控基因表達存在影響轉錄因子的結合活性與甲基化結合蛋白抑制轉錄直接和間接兩種機制，為研究中醫藥對癥治療與對證治療打開了思路。

1.2 血瘀證DNA甲基化研究進展

在DNA甲基化一系列的研究方法中，根據mRNA差異表達譜結果、生物信息學分析并結合血瘀證病理機制以及參考基因啟動子CpG島的注釋情況，選擇性檢測甲基化水平是目前血瘀證DNA甲基化的主要研究方法。王萍等[3]采用甲基化特異性PCR技術檢測家系CHD血瘀證、家系健康人KLF5和低密度脂蛋白受體相關蛋白12基因啟動子甲基化程度，結果發現2組該基因甲基化程度差異無統計學意義(P>0.05)。唐梅森等[4]運用焦硫酸測序技術檢測16例CHD血瘀證和8例非血瘀證患者ER-α、Gp6、AGTRAP基因啟動子區域的甲基化狀態，發現2組Gp6、AGTRAP基因啟動子區甲基化程度組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。向忠軍等[5]運用高通量芯片技術檢測3例CHD血瘀證和3例非血瘀證患者DES和CTNNB1啟動子甲基化程度，發現該基因可能是CHD血瘀證的危險因素。黃海波等[6]運用芯片檢測技術檢測20例CHD血瘀證、20例非血瘀證ZEB2和CHL1啟動子甲基化水平，結果顯示ZEB2與CHD血瘀證存在相關性，而CHL1則無相關性。

1.3 甲基化研究思路展望

由于甲基化本身的特點與中醫特色有著一種天然而隱約的聯系，其研究思路較為廣泛，以下僅談兩點展望。一是研究表明，DNA甲基化修飾的最終效應遠遠不止于調控基因表達，甚至可擴展到基因組印記、X染色體失活以及染色質結構修飾[7]。而基因印跡是一種決定是否表達由其來自父方或母方基因的現象，通過卵子和精子形成過程中DNA甲基化精細微妙的變化而實現。實際上，基因印跡是對來自父方和母方遺傳物質的一種選擇[8]，是在先天之精形成過程中適應性選擇的機制之一，為先天之精作用后天的研究提供了思路，從而為詮釋中醫體質對疾病發生發展及證候演變的影響提供了研究基礎。二是ncRNA可以通過調節DNMT的表達而調節DNA的甲基化，而相應的DNA甲基化亦可調控ncRNA的轉錄水平，因此ncRNA-DNA甲基化兩個層次的相互調節網絡，可能是中醫藥干預作用的連鎖放大效應機制之一，也可能是中藥作用的關鍵環節之一。

2 ncRNA

2.1 ncRNA研究基礎

ncRNA是不編碼蛋白質的功能性RNA分子。其中長度大于200nt的稱為長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA, lncRNA)，而長度小于200nt的稱為短鏈非編碼RNA(short noncoding RNA, sncRNA)，后者分為核內小RNA(small nuclear RNA, snRNA)、核仁小RNA(small nucleolar RNA, snoRNA)、胞質小RNA(small cytoplasmic RNA, scRNA)、小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)和微RNA(micro RNA, miRNA)[9-11]。目前CHD血瘀證的研究主要涉及miRNA，一類含有20～24個堿基的ncRNA，可以與mRNA的3‘或5’非翻譯區特異性結合，并借此調節蛋白質翻譯[12]，即通過miRNA同靶mRNA中的互補序列配對而調控基因表達[13]。其相關研究可以利用芯片或測序技術對不同組樣本進行差異miRNA篩選，并可通過熱圖、散點圖、火山圖直觀的表示，再利用TargetScan或miRanda軟件(Linux操作系統)或相關數據庫對差異miRNA調節的靶基因進行預測，并對靶基因富集分析，分析其調節的信號通路。另外，還可以通過分析相關mRNA差異表達譜結果，利用相關軟件預測可能對差異mRNA有調節作用的miRNA，再對預測的miRNA進行驗證，從而進一步明確調節mRNA差異的相關機制。

2.2 ncRNA研究進展

虞桂等[14-15]利用miRNA高通量芯片技術，對5例CHD不穩定心絞痛血瘀證及5例健康對照患者進行差異miRNA表達譜分析。結果顯示，23個miRNA上調，2個miRNA下調，并與mRNA差異表達譜結合進行生物信息學分析。結果發現，NOD樣受體信號通路、凋亡通路、細胞因子和受體相互作用通路與不穩定心絞痛血瘀證密切相關。鮑巖巖[16]則使用TaqMan低密度芯片技術，對CHD血瘀證24 h大鼠模型的心臟組織進行差異表達miRNA的篩選，結果顯示模型大鼠心臟組織中表達變化差異顯著的有16個miRNA，其中12個上調，4個下調；通過生物信息學方法構建調節網絡結合RT-PCR驗證的結果發現，PIK3CD、PPP3CA、PPP3R1、CASP3、IL1A顯著上調；構建miR-384-5p過表達和抑制的H9c2細胞模型，檢測PIK3CD蛋白水平，發現miR-384-5p下調，PIK3CD蛋白表達上調；通過雙熒光素酶報告基因分析miR-384-5p靶基因，并從細胞水平驗證miR-384-5p對靶基因的影響，結果顯示miR-384-5p可與PIK3CD的3’非編碼區結合，驗證了二者的靶基因關系。白瑞娜[17]利用高通量芯片技術，對CHD血瘀證、瘀毒輕證、瘀毒重證以及健康對照組患者各5例，篩選差異miRNA表達譜和差異lncRNA，結果顯示has-miR-1228-3p、has-miR-3157-3p組間差異顯著；血瘀證組差異表達的lncRNA為FR066195、TCONS_00017783等211條。功能學分析發現，差異miRNA參與免疫炎癥反應、血小板活化等病理過程，差異lncRNA與炎癥、免疫、細胞黏附等生物學過程相關，提示miRNA與lncRNA均參與了CHD血瘀證的發生發展過程。

2.3 ncRNA研究思路展望

miRNA具有明顯的表達階段特異性和組織特異性，且以多種形式存在于基因組中，但大多位于基因間隔區，其廣泛性、多樣性和復雜性提示其與中醫證候實質的關系密切。其在進化中高度保守，且血液中相對穩定，是其有望成為證候生物標志物的基礎。在動物細胞中，miRNA也是先由DNA轉錄成原miRNA(primary miRNA，pri-miRNA)，經過Drosha酶切加工后形成發卡結構的miRNA前體(miRNA precursor，pre-miRNA)，再經過Dicer酶環切后才形成miRNA成熟體，其后不翻譯成蛋白，其作用機制包括翻譯抑制、介導完全配對mRNA的降解、介導不完全配對的mRNA衰退、靶mRNA的翻譯抑制以及正調控和去抑制。因此，其調節的下游作用包括通過mRNA而影響蛋白表達代謝通路，通過調節DNA甲基化而影響DNA轉錄，調節組蛋白構象而影響染色質狀態等。由此可見，雖然調節網絡涉及多個分子層次，但miRNA可能成為藥物作用的關鍵靶點，通過與其他調節方式的相互作用實現“杠桿效應”。相比miRNA、lncRNA調控機制更為復雜和廣泛[18]，其通過與miRNA、轉錄因子、表觀遺傳修飾因子相互作用，以及誘餌、支架、向導、增強等作用機制，在轉錄前水平[19]、轉錄水平[20]、轉錄后水平[21]多種層面上調控基因表達水平。而新興的環狀RNA(circular RNA，circRNA)，是通過外顯子環化或內含子環化將3′和5′末端連接起來而形成閉合的共價環形結構，具有高度穩定性、高度保守性以及組織特異性以及時空表達特異性等特點，可與相應的miRNA發揮海綿作用，也可直接與相關蛋白質結果發揮調控作用，被研究者視為有望成為用于臨床診斷、治療敏感性預測及預后判斷的新型生物標志物。在內源競爭性RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)假說中，lncRNA與circRNA通過競爭性結合共有的miRNA結合位點彼此制約。可見，ceRNA網絡更適合作為作用機制研究的切入角度。

3 表觀遺傳學研究展望

3.1 表觀遺傳學與中醫藥學

表觀遺傳學的某些特性與中醫學的一些特點比較吻合，因此表觀遺傳學的研究方法對證候本質研究和中藥治療機制研究在思路上有很多啟示。一是環境可以影響表觀遺傳標記，從而影響基因功能[22]。表觀遺傳學的研究思路體現在環境與自身的相互作用而導致基因表型的變化，這與中醫證候發生發展時間特異性的理論基礎一致，所以從表觀遺傳學層面闡釋證候發生發展的機制前景良好；二是表觀遺傳學調控不僅能調節細胞的生命活動，而且能夠在有絲分裂中遺傳給子細胞，其遺傳特性為研究中醫治本和療效持續的特點提供了新思路；三是相對于細胞內蛋白質直接相互作用而言，表觀遺傳學的調控相對間接，而表觀遺傳學調控最重要的作用特點之一就是可逆轉[23]，這符合中醫治療雙向緩和的特色，為研究中藥作用機制提供新角度；四是在中藥作用機理研究方面。HSIEH等[24]對3294種中藥材中48 491個化合物進行研究，發現其中29.8%的中藥處方作用機制與表觀遺傳調控和miRNA有關。在政府批準的200種中藥復方中，99%的中藥復方與表觀遺傳調控和miRNA相關，而君藥最為顯著。另外，中藥的有效成分作為外源性miRNA也受到重視，其通過消化道進入血液，這些調控信息也許能夠作用于人體的基因調控過程，可能成為中藥的新作用機制；五是所有復雜生物的基因組是病毒和轉座子入侵的潛在目標，人類基因組45%是由遠古進入人體病毒DNA的遺留部分所演變[8]，基因組通過表觀遺傳相關的RNA沉默機制實現對入侵者特異性的免疫應答，而人體這個復雜系統與外界環境在基因水平交融中相互篩選、實現有序，與中醫天人相應理論關系密切。

3.2 表觀遺傳方法學展望

復雜性疾病是多基因遺傳和環境等因素相互作用的結果，而表觀遺傳學機制則能很好地體現環境和基因的交互作用[25]。但目前的相關研究尚存在數量和質量上的不足。首先，以中醫藥理論為指導與以分子生物學技術為支持是進行中醫表觀遺傳學研究的基礎。其次，作為證候生物標記物的研究，在考慮時間特異性和組織特異性的前提下，在獲得大樣本量標本的基礎上，運用統計方法將樣本分為訓練組與測試組，通過單變量Cox回歸方法，利用訓練組數據分析血瘀證高風險與低風險相關基因，建立風險預測模型，再利用測試組進行驗證模型的特異性和靈敏度。另外，作為機制研究，通過生物信息學方法構建調控網絡，并設計細胞和動物層面的功能學驗證必不可少，從而試圖捕捉網絡中調節的關鍵點即“網絡靶標”[26]，為進一步闡釋“表型網絡-生物分子網絡-藥物網絡”的病證方關系[27]和基因治療提供依據。同時，中醫藥傳統理論對于表觀遺傳學的研究也有重要的啟示意義。中醫理論經過數千年療效的驗證而積累了大量的客觀“結果”，若借此“反推”表觀遺傳學規律與本質，也許更容易接近真實。而陰陽學說則提示表觀遺傳學研究中更應注意“失衡”的分子機制，而并非單一靶點的研究。挖掘中醫藥傳統理論，為表觀遺傳學研究提供新思路，探索表觀遺傳調控的核心規律，這樣可以使兩個學科在更深層次上實現統一。

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ResearchProgressonBloodStasiswithCoronaryHeartDiseaseinTermsofEpigenetics

CHEN Guang1,2, GAO Jia-liang1, LIU Yong-mei1, WANG Jie1△

(1.Guang’anmenHospital,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100053,China; 2.BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

Researching the essence of Blood Stasis Syndrome in Coronary Heart Disease in the field of epigenetics mainly involves DNA methylation and non-coding RNA. The mechanism of DNA methylation regulation is integral, reversible and indirect, while the mechanism of non-coding RNA regulation is comprehensive, sundry and complicated. Overall, the regulation in epigenetics has obvious specificity in time and space and it is relatively indirect. It reflects the interaction between genes and environment and the thought ofcorrespondencebetweenheavenandhumankindandconceptofholism, which provides a chance for studying the essence of TCM syndrome and mechanism of Chinese medicinal.

Coronary heart disease; Blood Stasis Syndrome; epigenetics; DNA methylation; microRNA; Review

R541.4

A

1006-3250(2017)09-1336-04

國家自然科學基金面上項目(81473561)-冠心病血瘀證相關miRNA表達的甲基化調控機制研究；國家科技部“重大新藥創制”重大科技專項(2013ZX09301307)-宣痹安痛方藥物研發

陳 光(1991-)，男，住院醫師，在讀博士，從事中西醫結合防治心血管疾病的臨床與研究。

王 階，男，主任醫師，教授，博士研究生導師， 中國中醫科學院首席研究員，Tel:010-88001817,E-mail:wangjie0103@126.com。

2017-03-17