補(bǔ)腎益氣明目方組方藥物治療視神經(jīng)萎縮靶向機(jī)制初探*

趙子德，張瑩瑩，柏 梅，梁 俊，王軍杰，魏彬彬，王 影△

(1. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院眼科醫(yī)院，北京 100041； 2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院，北京 100700)

視神經(jīng)萎縮是由他病引起的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及其軸突變性，表現(xiàn)為嚴(yán)重的視功能受損，尚無(wú)有效的治療措施。唐由之教授是我國(guó)著名的中醫(yī)眼科學(xué)家，在視神經(jīng)萎縮(optic atrophy, OA)的中藥治療中積累了豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)，提出“補(bǔ)虛化瘀法”，并圍繞其經(jīng)驗(yàn)方補(bǔ)腎益氣明目方(黨參、丹參、川芎、山茱萸、菟絲子、枸杞子、女貞子、生芪、熟地、當(dāng)歸)加減，臨床收效顯著[1]。

復(fù)方多藥物組合及藥物多組分給臨床藥理研究帶來(lái)極大挑戰(zhàn)。理清藥物-疾病靶向關(guān)系對(duì)揭示復(fù)雜藥理機(jī)制極為必要。“生物活性導(dǎo)向下的化學(xué)研究思路”的提出，重視以中藥有效組分配伍的方劑架構(gòu)新模式[2]，因此借助開(kāi)放生物數(shù)據(jù)平臺(tái)，以中藥組分作用靶點(diǎn)為分析單元的臨床藥理研究，展現(xiàn)了極強(qiáng)的驅(qū)動(dòng)力[3-5]。本研究擬基于該平臺(tái)，對(duì)唐由之治療視神經(jīng)萎縮之補(bǔ)腎益氣明目方，通過(guò)數(shù)據(jù)挖掘初步探索該方有效組分及分子靶向性。

1 材料與方法

1.1 藥物有效組分及其靶點(diǎn)篩選

本研究通過(guò)檢索中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)(TCMSP: Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，http:∥ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)，在草藥名稱(chēng)“Herb name”中分別輸入各個(gè)中藥中文名稱(chēng)，進(jìn)入搜索“Search”后，再點(diǎn)擊結(jié)果中顯示的所輸入中藥的拉丁名稱(chēng)，在相關(guān)靶點(diǎn)“Related Targets”內(nèi)容中，便可獲取補(bǔ)腎益氣明目方中10味中藥相關(guān)的化合物及各化合物對(duì)應(yīng)的分子靶點(diǎn)，在此基礎(chǔ)上，結(jié)合藥物靶點(diǎn)和藥物作用信息數(shù)據(jù)庫(kù)Drugbank(http:∥www.drugbank.ca/檢索時(shí)間2015-7-18)，從中提取上述各中藥已被驗(yàn)證的有效組分及其對(duì)應(yīng)的分子靶點(diǎn)信息。

1.2 OA疾病靶標(biāo)獲取

利用囊括人類(lèi)遺傳、基因表型及疾病基因圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man http:∥omim.org/檢索時(shí)間2015-11-29)，以“optic atrophy”為檢索詞進(jìn)行搜索，從顯示結(jié)果中便可獲取數(shù)據(jù)庫(kù)中收集的OA致病相關(guān)分子，將此作為本次研究的疾病靶標(biāo)。

1.3 藥物-疾病靶向分析

藥物作用被歸類(lèi)為“中靶”與“脫靶”兩種效應(yīng)，藥物直接擾動(dòng)致病分子是靶向治療的主要形式。通過(guò)篩選具有直接擾動(dòng)OA分子靶標(biāo)的藥物、有效組分及其靶點(diǎn)信息，利用文獻(xiàn)挖掘與信號(hào)通路數(shù)據(jù)庫(kù)KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http:∥www.kegg.jp)進(jìn)行信號(hào)通路信息比對(duì)，初步探索其靶向機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 藥物組分及其靶點(diǎn)

通過(guò)檢索中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)，從中提取補(bǔ)腎益氣明目方中各中藥已被Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證的有效組分，得到黨參、熟地、丹參、當(dāng)歸、川芎、枸杞子、山茱萸、女貞子、菟絲子、生芪被驗(yàn)證的組分?jǐn)?shù)目分別為11、5、20、6、14、14、22、19、7、13；上述各藥物有效組分涉及的靶點(diǎn)基因符號(hào)(gene symbol)數(shù)目分別為133、48、180、28、138、172、135、285、156、218。

2.2 OA疾病靶標(biāo)

通過(guò)OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)獲得視神經(jīng)萎縮疾病相關(guān)靶標(biāo)分子(Gene Symbol)379個(gè)。

2.3 藥物-疾病靶向分析

通過(guò)將經(jīng)驗(yàn)方中各藥物靶點(diǎn)與視神經(jīng)萎縮靶標(biāo)進(jìn)行比對(duì)，本研究最終確定上述10味中藥中的有效組分直接擾動(dòng)視神經(jīng)萎縮靶標(biāo)分子數(shù)目分別為1、0、2、0、0、3、2、3、5、3，其中涉及5個(gè)有效組分luteolin(木犀草素)、protocatechuic acid(原兒茶酸)、quercetin(槲皮素)、vitamin A(維生素A)和sesamin(芝麻脂素)，5個(gè)直接擾動(dòng)靶標(biāo)EGFR(Epidermal growth factor receptor)、KIF21 A(Kinesin family member 21 A)、GJA1(Gap junction alpha-1)、ACOX1(Acyl-CoA oxidase 1)、G6PD(Glucose-6-phosphate dehydrogenase)。

3 討論

研究表明，攻擊單個(gè)靶標(biāo)對(duì)于復(fù)雜疾病幾乎沒(méi)有影響[6]，這可能源于系統(tǒng)具有魯棒性，而抑制多個(gè)靶標(biāo)比單一抑制更加有效，因此設(shè)計(jì)多靶點(diǎn)干預(yù)的有效藥物組合極具挑戰(zhàn)。本文針對(duì)補(bǔ)腎益氣明目方10味組方藥物的直接作用靶點(diǎn)和OA疾病靶標(biāo)進(jìn)行挖掘，OA顯示其多基因復(fù)雜疾病特點(diǎn)，所有藥物均呈現(xiàn)多組分多靶點(diǎn)特征，其中黨參、丹參、枸杞子、山茱萸、女貞子、菟絲子、生芪的有效組分能直接干預(yù)OA靶標(biāo)，且藥物中靶顯示出高度集中性。其中，菟絲子所含有效組分(sesamin、quercetin)占有最高“中靶率”，并呈現(xiàn)多角度干預(yù)。

3.1 促神經(jīng)細(xì)胞的生成及穩(wěn)態(tài)

結(jié)果顯示，黨參、丹參、枸杞子、女貞子、菟絲子、黃芪均可直接直接調(diào)控EGFR分子。EGRF是一種絡(luò)氨酸激酶受體(RTK)，研究表明EGFR與配體結(jié)合促進(jìn)自噬體與溶酶體的融合，從而維持神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的穩(wěn)定狀態(tài)[7]，防止細(xì)胞變性，而在受損區(qū)域星形膠質(zhì)細(xì)胞可以形成不成熟的神經(jīng)細(xì)胞[8]，隨后又發(fā)育為成熟的神經(jīng)細(xì)胞。而在果蠅體內(nèi)，EGFR與配體Spitz(一種被視為轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子-α樣配體)結(jié)合時(shí)能促進(jìn)神經(jīng)上皮的增殖和成神經(jīng)細(xì)胞的形成[9]。另外，利用軸突蛋白tau和神經(jīng)元蛋白β微管蛋白/神經(jīng)絲評(píng)估神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中軸突再生程度時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)EGFR過(guò)表達(dá)時(shí)Tau蛋白和β微管蛋白/神經(jīng)絲被上調(diào)，在EGFR被阻斷時(shí)后者被下調(diào)[10]，同時(shí)這種調(diào)控模式被發(fā)現(xiàn)存在于EGFR與mTOR和Akt之間，mTOR和Akt則在胎兒鼠和幼鼠的神經(jīng)元細(xì)胞中高度表達(dá)，而在老年鼠中低表達(dá)，這表明EGFR在mTOR和PI3K / Akt通路激活條件下具有調(diào)節(jié)神經(jīng)元固有再生的重要潛力。

3.2 胞間信號(hào)傳導(dǎo)及運(yùn)輸動(dòng)力調(diào)控

GJA是枸杞子、山萸肉、女貞子、菟絲子、黃芪共同的目標(biāo)調(diào)控分子,是一種間隙連接蛋白，這種蛋白在人類(lèi)視神經(jīng)網(wǎng)膜組織中主要表達(dá)于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、血管和上皮細(xì)胞，并參與線粒體基質(zhì)離子流動(dòng)和呼吸調(diào)節(jié)。6個(gè)連接蛋白形成一個(gè)連接子或質(zhì)膜半通道，這種通道具有相對(duì)非特異性，允許小于1000道爾頓的分子以被動(dòng)擴(kuò)散的形式通過(guò)，如可以影響細(xì)胞發(fā)育命運(yùn)被稱(chēng)為形態(tài)發(fā)生素的一組生化分子等。在病理?xiàng)l件下，損傷的細(xì)胞可能通過(guò)間隙連接影響周?chē)】导?xì)胞，相反必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也可以通過(guò)間隙連接供給臨近健康細(xì)胞而避免損傷。研究表明,間隙連接蛋白可能牽連著中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后神經(jīng)元死亡的病理[11]。利用基因敲除/敲入技術(shù)，連接蛋白被證實(shí)對(duì)腦組織缺血再灌注損傷具有重要保護(hù)作用[12]。在誘導(dǎo)細(xì)胞毒性或缺血條件下，間隙蛋白的藥理阻斷還可以終止幾乎所有視網(wǎng)膜無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞的丟失以及降低大部分神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的丟失[13]。此外，EGFR和GJA同位于間隙連接通路(Gap junction pathway)的上游位置，且該通路顯示涉及視皮層與視網(wǎng)膜功能、細(xì)胞凋亡、鈣離子平衡等調(diào)控。間隙連接包含細(xì)胞間通道，不同于體內(nèi)神經(jīng)、內(nèi)分泌交互機(jī)制，這允許相鄰細(xì)胞之間通過(guò)細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行短程通訊[14]。間隙連接通訊被認(rèn)為不論對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)還是外周神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘和軸突生存都至關(guān)重要[15]，分別通過(guò)介導(dǎo)少突-星形膠質(zhì)細(xì)胞間和雪旺氏細(xì)胞間的胞間通訊。在脫髓鞘神經(jīng)膠質(zhì)中，間隙連接調(diào)控著生理過(guò)程，如細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、鈣信號(hào)傳導(dǎo)以及參與連接蛋白構(gòu)成的半通道所釋放的神經(jīng)遞質(zhì)介導(dǎo)的細(xì)胞外信號(hào)傳導(dǎo)。因此，針對(duì)這類(lèi)間隙蛋白的干預(yù)被認(rèn)為是新的治療策略，以減少神經(jīng)病理?xiàng)l件下逐漸損失的細(xì)胞。

另外，KIF21 A是正端走向驅(qū)動(dòng)蛋白家族中的一員，在神經(jīng)元中這一蛋白通過(guò)利用ATP水解釋放能量，沿軸突微管運(yùn)輸必要細(xì)胞組分[16]，驅(qū)動(dòng)蛋白活性的嚴(yán)格調(diào)節(jié)與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及神經(jīng)系統(tǒng)致病密切相關(guān)[17-18]，盡管較多的研究集中在KIF21 A與眼動(dòng)神經(jīng)之間的關(guān)系。因此，方中藥物針對(duì)EGFR、GJA、KIF21 A的調(diào)控關(guān)系到胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及運(yùn)輸動(dòng)力調(diào)控等方面，可能涉及神經(jīng)細(xì)胞重要的物質(zhì)和能量代謝過(guò)程。

3.3 抑制退行進(jìn)程與抗氧化

過(guò)氧化物酶體酰基輔酶A氧化酶是由ACOX1編碼的一種蛋白，ACOX1的缺乏是過(guò)氧化物酶體長(zhǎng)鏈脂肪酸氧化的一種罕見(jiàn)性疾病，它的缺乏在人類(lèi)可能引起包括視神經(jīng)萎縮在內(nèi)的致命性神經(jīng)退化過(guò)程，即神經(jīng)元的丟失導(dǎo)致持續(xù)脫髓鞘改變[19]，嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)異常在該基因敲除小鼠模型中同樣可以觀察到[20]。G6PD是一種存在于人體紅細(xì)胞內(nèi)、協(xié)助葡萄糖進(jìn)行新陳代謝的酵素。研究表明，G6PD的缺乏可以降低缺血性視神經(jīng)病變的風(fēng)險(xiǎn)[21]，這可能是由于其缺乏而導(dǎo)致NADPH產(chǎn)生不足，降低NADPH依賴(lài)的氧化酶衍生的活性氧，保護(hù)組織或器官免受氧化損傷[22]。然而G6PD似乎是把雙刃劍，這源于其高表達(dá)在缺血再灌注期間又呈現(xiàn)出對(duì)抗DNA氧化損傷及防止神經(jīng)退行性病變等神經(jīng)保護(hù)作用[23]。

綜上可見(jiàn)，唐由之經(jīng)驗(yàn)方組方藥物可能通過(guò)其有效組分直接命中多個(gè)OA靶標(biāo)，其機(jī)制涉及促神經(jīng)細(xì)胞的生成及穩(wěn)態(tài)、胞間信號(hào)傳導(dǎo)、胞間運(yùn)輸動(dòng)力調(diào)控、抑制退行進(jìn)程、抗氧化等神經(jīng)再生和神經(jīng)保護(hù)等。組方藥物間存在共享和獨(dú)有靶點(diǎn)，預(yù)示著可能存在藥物聯(lián)合應(yīng)用的復(fù)雜機(jī)制或組方機(jī)制。在此，大數(shù)據(jù)分析為深入揭示方證、方病相關(guān)性帶來(lái)巨大潛力[24]，未來(lái)研究將基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)理論框架進(jìn)一步解析該組方藥物有效組分靶點(diǎn)與OA疾病靶標(biāo)之間的復(fù)雜關(guān)系，并進(jìn)行生物學(xué)驗(yàn)證，揭示其組方機(jī)制，指導(dǎo)臨床用藥(致謝：感謝唐由之教授對(duì)本研究的支持)

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