血清肌鈣蛋白-I均相化學發光免疫檢測方法的建立

董 明

（湖北省十堰市鄖西縣中醫醫院檢驗科，湖北 十堰 442600）

血清肌鈣蛋白-I均相化學發光免疫檢測方法的建立

董 明

（湖北省十堰市鄖西縣中醫醫院檢驗科，湖北 十堰 442600）

目的 通過光激化學發光法建立一種血清肌鈣蛋白-I的均相免疫檢測方法，并探究其應用價值。方法 我院2015年2月至2015年8月間收治的急性心肌梗死患者50例作為研究對象，并以同期接受體檢的健康志愿者50例作為對照，采用光激化學發光法建立的免疫檢測法對其血清肌鈣蛋白-I水平進行測定，并對該方法進行評價。結果 高值血清、中值血清、低值血清標本的批內、批間變異系數均≤10%，重復性良好；分析靈敏度與功能靈敏度分別為0.048 ng/mL、0.055ng/mL，加入干擾物后的干擾率均≤10%，加入不同濃度標準品后的回收率分別為106.56%、103.73%。本文建立的實驗結果與直接化學發光法檢測結果相關性良好（r2=0.982）。結論 在光激化學發光法基礎上建立的血清肌鈣蛋白-I檢測方法，具有檢測精密度高、重復性好，靈敏度、特異性、準確度俱佳，抗干擾能力強，且無需清洗分離的優點，通過方法的進一步優化可以為臨床推廣應用奠定基礎。

血清肌鈣蛋白-I；急性心肌梗死；化學發光免疫法；檢測

本文就我院2015年2月至2015年8月間收治的急性心肌梗死患者50例作為研究對象，以光激光化學發光法為基礎建立一種血清肌鈣蛋白-I檢測方法，分析其檢測效果，并對其進行方法學評價。具體報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選取我院2015年2月至2015年8月間收治的急性心肌梗死患者50例作為研究對象，所有患者均符合中華醫學會心血管分會制定的《急性心肌梗死診斷和治療指南》中的相關診斷標準。50例患者中，男31例，女19例；年齡在34～82歲，平均（52.1±3.7）歲。另取同期在我院接受體檢的健康志愿者50例作為對照，其中，男30例，女20例；年齡在34～79歲，平均（51.5±3.5）歲。兩組受檢者在性別、年齡等方面的比較均無統計學差異，P＞0.05，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 血清肌鈣蛋白-I檢測方法的建立。制備肌鈣蛋白-I受體-受體微球：使用濃度為0.05 mol/L的MES緩沖液度對預標記的肌鈣蛋白-I多克隆抗體進行透析，并通過紫外分光光度儀對其濃度進行測定。在0.05 mL MES緩沖液中加入0.5 mg發光微球行超聲再懸浮后，將其與0.1 mg處理后的抗體、MES緩沖液混勻得到反應液，加入25倍氰基硼氫化鈉，在室溫下連續反應48 h，再加入體積為反應液1/5和1/10的甘氨酸、氰基硼氫化鈉旋轉反應后，按照5∶8的比例加入牛血清白蛋白，過夜反應，反應溫度為4 ℃。經MES緩沖液清洗后，將得到的受體微球進行稀釋，稀釋濃度為1 mg/mL。

標記生物素并配制標準品：以3 mL DMF溶解活化生物素0.1 g，逐漸加入肌鈣蛋白-I單克隆抗體溶液中，室溫反應1 h后，以PBS溶液透析，將游離生物素去除后，分裝保存。將肌鈣蛋白-I純品用滅活小牛血清、PBS溶液配制成濃度分別為0、2.5 ng/mL、8 ng/mL、24 ng/mL、36 ng/mL、100 ng/mL的標準品溶液，標定后分裝備用。

測定：在發光微孔板內依次加入生物素標記抗體、標準品（待測樣本）、受體球（均為25 μL）混勻后，于避光條件下加入鏈霉素及供體微球（加入量為175 μL），混勻后讀取光信號值，肌鈣蛋白-I標準品-光信號值的標準曲線繪制完成后，可以據此獲得待測樣本中肌鈣蛋白-I的水平。

1.2.2 方法學評價。精密度評價：采集健康志愿者的血液標本，通過處理后將獲得的血清混合，并將其配制成不同濃度的待測標本，保存在-20 ℃的冰箱中待檢，同一實驗的同一標本做十次檢驗，并對其批內精密度進行計算；同時，對3種不同標本連續10 d的測定值進行記錄，計算批間精密度。

靈敏度評價：選擇不含肌鈣蛋白-I的標準品進行反復測定，記錄十次測得的光信號值，并分別計算其平均數與標準差，利用標準曲線對分析靈敏度進行計算；同時，選擇低值樣本再次進行倍比稀釋，分裝保存，將統一系列不同值的樣本進行連續測定，每天重復精密度為20%的對應濃度記為功能靈敏度。

特異性評價：分別向低值血清與高值血清中加入血紅蛋白（5 g/L）、三酰甘油（11 mol/L）、總膽紅素（240 μmol/L）、蛋白質干擾物（12 mg/dL）進行干擾實驗，并以加入不含肌鈣蛋白-I等體積基質的樣本為基礎樣本，分別對其濃度進行測定，并以基礎樣品測定濃度與分析樣品測定濃度之差/基礎樣品測定濃度的百分比為干擾率。

準確度評價：將混合后的健康志愿者血清分3份，并在其中2份中加入等體積的標準品，濃度分別為8 ng/mL、36 ng/mL，另一份中加入無肌鈣蛋白-I的基質，分貝對不同樣品的濃度值進行檢測，并按照分析樣品測定濃度與基礎樣品測定濃度之差/加入濃度的百分比為回收率。

與直接化學發光法檢測結果的相關性實驗：分別采集50例急性心肌梗死患者的血液標本，采用本文建立的方法與直接化學發光法分別進行測定，并行相關性實驗。

1.3 統計學方法：本次實驗數據采用SPSS12.0軟件進行統計學分析，相關性分析采用person分析法，P＜0.05具有統計學差異。

2 結 果

2.1 精密度：高值血清、中值血清、低值血清標本的批內變異系數分別為5.23%、4.97%、3.41%，批間變異系數分別為7.23%、8.54%、8.22%，均≤10%，重復性良好。

2.2 靈敏度：經計算，分析靈敏度與功能靈敏度分別為0.048 ng/mL、 0.055 ng/mL。

2.3 特異性：低值血清加入血紅蛋白、三酰甘油、總膽紅素、蛋白質干擾物后的干擾率分別為9.21%、9.34%、9.18%、9.03%；高值血清中加入血紅蛋白、三酰甘油、總膽紅素、蛋白質干擾物后的干擾率分別為8.23%、8.02%、8.00%、7.81%。

2.4 準確度：加入濃度為8 ng/mL的標準品后，回收率為106.56%；加入濃度為36 ng/mL的標準品后，回收率為103.73%。

2.5 與直接化學發光法的相關性：將本文建立的實驗結果與直接化學發光法檢測結果進行相關性分析，r2=0.982，相關性良好。

3 討 論

近年來，隨著經濟水平的發展和物質生活水平的不斷提高，人們的生活方式、飲食結構都出現了巨大的改變，與之密切相關的心血管疾病發生率也呈現快速上升的趨勢，嚴重威脅人類的健康和生命安全。急性心肌梗死就是十分嚴重的一種，早期發現、診斷和治療是挽救急性心肌梗死患者的重要途徑[1]，特別是對于非ST段抬高型的急性心肌梗死患者而言，其臨床癥狀不典型，心電圖改變不明顯，容易被忽視而造成嚴重后果，而血清肌鈣蛋白-I作為一種心肌損傷標志物在心肌損傷的診斷中具有良好的敏感性和很高的特異性，被認為是急性心肌梗死的診斷金標準[2]，對血清肌鈣蛋白-I的水平進行定量測定也可以對心肌梗死面積進行反映，利于繼發性心肌梗死或者復發性心肌梗死患者的及時發現[3]。

臨床檢測血清肌鈣蛋白-I的方法包括金標免疫層析法、酶聯免疫分析法、放射免疫法等多種，金標免疫層析法在實踐應用中雖然操作簡便，標本用量也很少，但其受主觀影視影響大，且無法實現定量測定；酶聯免疫分析法的顯色靈敏度較低，同樣無法實現完全的定量測定；而放射免疫法的放射污染大，使用限制較大。化學發光免疫分析法雖然同時具備了良好的檢測靈敏度、特異性，能夠實現自動化定量分析，但檢測費用較高，推廣難度大。選擇一種靈敏度高、特異性強、背景干擾小、安全性好、精度高、能實現定量檢測、經濟性好、普及度廣的肌鈣蛋白-I檢測方法對于急性心肌梗死患者具有重要意義。

本實驗中使用的光激化學發光系統以能量的近距離轉移為核心，可以在抗原-抗體特異性反應的基礎上，把激發態單線態氧供體球的極短距離傳遞，轉移到受體球，并使其發光，通過繪制不同濃度標準品對應的光信號值制作標準曲線，并獲得可以用來測定樣本被測物含量的數學模型，其有檢測均相，無需清洗分離的優勢[4]，以雙抗體夾心法為基礎，通過光激化學發光系統的應用，能夠實現血清肌鈣蛋白-I的快速、敏感檢測，且價格相對較低。本文對該法進行方法學評價，可見其精密度高、重復性好，且有良好的靈敏度、特異性、準確度，抗干擾能力強。將其與直接化學發光法的測定結果進行相關性分析，則可見其r2為0.982，相關性好，檢測效果可靠。當然，在實踐應用過程中，還需對相關的實驗條件進行優化，對相關問題進行進一步分析和解決，為其臨床推廣奠定基礎。

[1] 程敏卓,張向輝,趙衛國.基于光激化學發光技術開發的多表位檢測cTnI的方法[J].免疫學雜志,2014,30(9):825-827.

[2] 石興景.兩種方法測定肌鈣蛋白I結果的比對分析[J].中國醫療前沿,2011,6(8):67-69.

[3] 賈娟娟,劉一兵,張雪峰,等.人心肌肌鈣蛋白I酶促化學發光免疫分析方法的建立[J].標記免疫分析與臨床,2012,19(5):282-284.

[4] 李玉芹,牛文彥,朱黎娜,等.血清肌鈣蛋白-I均相化學發光免疫檢測方法的建立[J].實用醫學雜志,2014,30(10):1640-1642.

R542.2+2

B

1671-8194（2017）18-0171-02