甘草酸對大鼠空腸收縮作用的研究

沈德利 郭喜順

（大連市第三人民醫院藥劑科，遼寧 大連 116033）

甘草酸對大鼠空腸收縮作用的研究

沈德利 郭喜順

（大連市第三人民醫院藥劑科，遼寧 大連 116033）

目的分析甘草酸對胃腸收縮的作用。方法制作大鼠離體空腸標本，記錄不同濃度的甘草酸對大鼠離體空腸平滑肌正常收縮的影響。結果甘草酸劑量依賴性地促進了大鼠離體空腸的平滑肌收縮；甘草酸對腸平滑肌的興奮作用可分別被 M 受體阻斷藥阿托品及鈣通道阻滯劑維拉帕米阻斷。討論甘草酸明顯促進大鼠離體空腸平滑肌收縮作用，呈劑量依賴性；在4種不同低收縮狀態下，其興奮作用仍然存在。

甘草酸；空腸；平滑肌收縮

甘草酸是甘草中最重要的活性成分，有抗衰老、抗炎、抗過敏、降壓、增強免疫力、抑制癌細胞生長等作用[1-2]。離體實驗發現，甘草煎劑能增加大鼠胃底縱行肌和環行肌張力、胃體縱行肌張力和幽門環行肌運動指數，具有促進胃腸動力作用[3-4]。本研究考察了甘草酸對大鼠離體空腸收縮的調節作用并初步揭示其作用機制。見下文。

1 材料與方法

1.1 實驗材料：①實驗動物SD大鼠，雄性，180～220 g，大連醫科大學實驗動物中心提供。②主要儀器、設備。HM-3S型pH計：日本東亞電波工業株式會社產品；MA240D型電子分析天平：上海第二天平儀器廠產品；CJ-1磁力攪拌器：上海滬西分析儀器廠產品；漩渦混合器：江蘇海門麒麟醫用儀器廠產品；PS-9型電泳儀：大連捷邁科技公司；UVP凝聚成像系統：英國UVP有限公司；FTC51F2D PCR儀：英國巴羅世界科技公司；HW-400S恒溫平滑肌槽，BL-420F生物機能實驗系統：成都泰盟科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 離體小腸平滑肌條的制備：大鼠預先禁食48 h，但給水，脫頸處死大鼠，剖腹，取1.5～2 cm空腸，除去腸系膜，放于克氏液中備用。浴管內克氏液保持恒溫37 ℃。L型管置于浴管內。

1.2.2 標本連接：將平滑肌置入裝有20 mL的37 ℃克氏液浴槽中，并通以95%O2和5% CO2，穩定約50 min，開始記錄收縮曲線。

1.2.3 便秘模型建立：健康雌雄各半的SD大鼠正常飼養3 d后，剔除有異常反應或體質量有明顯差異的大鼠后，隨機分為正常對照組，便秘模型組，便秘模型給藥組，每組6只，單只單籠飼養，事先稱重。

1.2.4 Western blotting：在各實驗組大鼠取血后，自幽門下10 cm處切取空腸8 cm，4 ℃克氏液洗凈，切成2 cm長的腸段，立即置于液氮中，然后-80 ℃保存待測。總蛋白提取：稱量空腸組織，配裂解液，裂解液與組織按500 μL：100 mg混合，剪碎組織，勻漿，離心15000 r，15 min，取上清，測蛋白濃度，將所有樣品蛋白濃度均稀釋至最低濃度，按1∶1加上樣緩沖液100 ℃煮沸5 min，-20 ℃保存。電泳：配12%分離膠和5%濃縮膠，上樣，電泳至溴酚藍剛跑出即可，停止電泳，取膠。轉膜：按濾紙（3層）-PVDF膜-膠-濾紙（3層）放入電轉槽，吸干電轉液，通電25 min。封閉。免疫反應：將MLC、P-MLC、MLCK以及β-actin蛋白抗體分別配成1∶1000和1∶800的濃度，4 ℃孵育過夜，然后用TTBS室溫下脫色搖床洗3次，每次5 min。同上方法用稀釋二抗（1∶2000），室溫下孵育90 min，用TTBS室溫下，脫色搖床上洗3次，每次5 min。化學發光，顯影，定影，凝膠圖像分析：將發光底物工作液A和B等體積混合1 min后，將蛋白與此混合液充分避光接觸1 min，顯影，進行圖像掃描分析。1.3 統計處理：用統計分析方法處理平滑肌收縮幅度變化。SPSS18.0對數據進行統計分析，實驗數據用均數±標準差（x-±s）表示，t檢驗，P＜0.05具有顯著性意義。

2 結 果

2.1 正常收縮狀態下甘草酸對大鼠空腸收縮作用：平滑肌收縮穩定后，在浴槽中依次加入不同濃度的甘草酸，其終濃度分別為20、40、80 μmol/L。觀察并記錄5 min內的收縮曲線，取均數后作為實驗數據。甘草酸對大鼠空腸平滑肌的收縮活動有興奮作用，且與劑量呈正向關系。

2.2 甘草酸對空腸收縮作用的機制探討：鈣離子是平滑肌收縮的關鍵因子，M受體是興奮平滑肌的經典受體，能夠促進平滑肌的收縮。因此，在本實驗中考察鈣離子，M受體與甘草酸所起興奮作用的關系。

平滑肌收縮穩定后，分別向克氏液中加入1.0 μmol/L鈣通道阻滯劑維拉帕米（verapamil）及10.0 μmol/L M受體阻斷劑阿托品（atropine），然后依次加入不同濃度的甘草酸，其終濃度分別為20、40、80 μmol/L。觀察并記錄5 min內的收縮曲線，取均數后作為實驗數據。鈣通道和M受體被阻斷情況下甘草酸對大鼠空腸平滑肌的收縮活動有興奮作用，且與劑量呈正向關系。

2.3 甘草酸對肌球蛋白磷酸化的影響：模型大鼠小腸組織中肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）和肌球蛋白磷酸化水平均顯著低于正常對照組，甘草酸可以顯著增加MLCK的含量和肌球蛋白磷酸化水平。

3 討 論

本研究結果表明，在20、40、80 μmol/L濃度條件下，甘草酸對空腸平滑肌收縮均可起到明顯的興奮作用，并且隨著濃度增大，興奮作用更加明顯。本結果提示，在20～80 μmol/L劑量范圍內，甘草酸對空腸平滑肌收縮起到劑量依賴性的興奮作用。

為進一步驗證甘草酸的作用，本研究又探討了在低鈣、低鉀、腎上腺素、硝普鈉4種不同條件造成的平滑肌低收縮狀態下，甘草酸對空腸平滑肌收縮作用的影響。結果表明，在這4種條件造成的平滑肌低收縮情況下，甘草酸對空腸平滑肌收縮依然可起到明顯的興奮作用。提示，甘草酸對空腸平滑肌的收縮的興奮作用進一步得到驗證[5-6]。

本研究還研究了甘草酸對空腸平滑肌收縮所起到作用可能的機制。平滑肌收縮是在鈣離子參與下，肌球蛋白輕鏈激酶催化肌球蛋白輕鏈磷酸化實現的。胃腸道中存在的M受體能興奮平滑肌的收縮。本研究中分別應用鈣通道阻斷劑維拉帕米和M受體阻斷劑阿托品來探討機制。結果表明，在克氏液中加入維拉帕米后，平滑肌收縮急劇下降，待收縮平衡后，再分別加入20、40、80 μmol/L的甘草酸，結果3個劑量的甘草酸對平滑肌收縮均不能起到興奮作用。這表明維拉帕米阻斷了甘草酸對平滑肌收縮的興奮作用，甘草酸對空腸平滑肌收縮的興奮作用是鈣依賴性的。在克氏液中加入M受體阻斷劑阿托品后，平滑肌收縮基本沒發生變化，待平滑肌收縮穩定后，再分別向克氏液中加入20、40、80 μmol/L的甘草酸，結果這3個劑量的甘草酸對平滑肌收縮的興奮作用檢測不到了。表明阿托品阻斷了甘草酸對空腸平滑肌收縮的作用，即甘草酸對平滑肌收縮的興奮作用依賴于M受體的激活。

為進一步研究甘草酸對空腸平滑肌收縮所起到的作用，我們考察了甘草酸對小腸組織中肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）含量及肌球蛋白磷酸化的影響。結果表明，便秘模型組小腸組織中MLCK含量及肌球蛋白磷酸化水平顯著低于正常對照組，加入甘草酸可以顯著恢復MLCK含量和肌球蛋白磷酸化水平。結果揭示了甘草酸是通過增強肌球蛋白磷酸化水平實現對平滑肌收縮的興奮作用。

簡而言之，本研究的結果提示，在20～80 μmol/L劑量范圍內，甘草酸對空腸平滑肌收縮所起到顯著的興奮作用，這種興奮作用是鈣依賴性的，并依賴于M受體的激活，增強肌球蛋白磷酸化水平實現的。

[1] 周榮漢.中藥資源學[M].北京:中國醫藥科技出版社,1993:299.

[2] 鄭虎占,董澤宏,余靖,等.中藥現代研究與應用[M].北京:學苑出版社,1997:1256-1279.

[3] 劉麗萍,任翠愛,趙宏艷.甘草酸的免疫調節作用研究進展[J].中國實驗方劑學雜志,2010,16(6):272-276.

[4] 齊敏.甘草酸藥理作用及機制的研究進展[J].牡丹江醫學院學報,2009,30(3):79-81.

[5] 徐立昌,鄭淑玲,張偉東,李魁興.甘草酸的藥理機制研究進展[J].中外醫療,2009,28(26):174-175

[6] 鄒龍,王連平.正交試驗法優選護肝醒酒濃縮丸的醇提工藝[J].中南藥學,2013,11(1):14-18.

R282.710.7 文獻標識碼：B 文章編號：1671-8194（2017）30-0023-02