瘧疾的實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測(cè)方法探討

張國(guó)斌

（沈陽市疾病預(yù)防控制中心，遼寧 沈陽 110031）

瘧疾的實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測(cè)方法探討

張國(guó)斌

（沈陽市疾病預(yù)防控制中心，遼寧 沈陽 110031）

目的 探討瘧疾的實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測(cè)方法。方法 選擇本市國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心提供的瘧疾鏡檢陽性血樣20份，另選擇健康者（瘧疾鏡檢陰性）血樣20份作為待測(cè)血樣。本研究設(shè)計(jì)了瘧疾病原體實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測(cè)的引物和探針，總結(jié)了快速檢測(cè)方法，瘧疾鏡檢陽性/陰性血樣均各分為4次檢測(cè)完畢，統(tǒng)計(jì)各份血樣檢測(cè)結(jié)果和每次檢測(cè)時(shí)間，計(jì)算平均用時(shí)和瘧疾鏡檢與實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)符合率。結(jié)果 瘧疾鏡檢陽性血樣20份，檢測(cè)4次，平均用時(shí)（19.15±1.34）min，瘧疾鏡檢陰性血樣平均用時(shí)為（19.52±1.49）min，40份血樣熒光PCR檢測(cè)平均用時(shí)（19.34±1.65）min。在熒光PCR檢測(cè)與瘧疾鏡檢符合率方面，陽性血樣（100%）和陰性血樣（90.00%）比較，無顯著差異P＞0.05，認(rèn)為無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。40份待測(cè)血樣熒光PCR檢測(cè)和瘧疾鏡檢符合率為95.00%（38/40）。結(jié)論 本研究瘧疾病原體實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測(cè)準(zhǔn)確性高，陽性檢出高，檢測(cè)時(shí)間段，用于瘧疾快速檢驗(yàn)可行性較強(qiáng)，不易發(fā)生漏檢情況。

瘧疾；實(shí)時(shí)熒光；PCR；快速檢測(cè)；巢式PCR

瘧疾是我國(guó)流行病防治的重點(diǎn)，檢測(cè)診斷多依靠瘧原蟲形態(tài)檢查、抗體血清學(xué)檢查以及瘧原蟲體抗原檢測(cè)等方法，鏡檢是較為可靠的瘧原蟲檢測(cè)方法，但存在各種限制因素，假陰性率較高，較容易出現(xiàn)漏診情況，故需要探索一套更為靈敏、快捷的檢測(cè)方法[1]。為此，為此，本研究設(shè)計(jì)了瘧疾病原體實(shí)時(shí)熒光 PCR快速檢測(cè)的引物和探針，總結(jié)了一套快速檢測(cè)方法，選擇本市國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心提供的瘧疾鏡檢陽性血樣20份，另選擇健康者（瘧疾鏡檢陰性）血樣20份作為待測(cè)血樣，統(tǒng)計(jì)各份血樣檢測(cè)結(jié)果，對(duì)比分析了瘧疾鏡檢與實(shí)時(shí)熒光 PCR 檢測(cè)符合率，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料：選擇本市國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心提供的瘧疾鏡檢陽性血樣20份，另選擇健康者（瘧疾鏡檢陰性）血樣20份作為待測(cè)血樣。40份血樣均為靜脈血，采用真空采血管（2%EDTA-Na2抗疑）采血，在本實(shí)驗(yàn)室按要求（20 ℃）保存。

1.2 試劑及DNA提取：本單位采用Qiagen公司全血DNA提取試劑盒和熒光PCR試劑。按QIAamp DNA Blood Extraction Minikit提取瘧原蟲DNA并低溫保存。

1.3 引物設(shè)計(jì)合成：惡性瘧、間日瘧、三日瘧和卵形瘧的SSU rRNA基因的引物和探針，由上海生工生物工程公司合成，包括實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的引物、探針。各引物擴(kuò)增參數(shù)為：Plas-FP 、Plas-RP和Plas-Pro擴(kuò)增長(zhǎng)度73 bp；rPLUout-FP和rPLUout-RP擴(kuò)增長(zhǎng)度1815 bp；rPLUin-FP和rPLUin-RP擴(kuò)增長(zhǎng)度240 bp。使用TaqMan體系配置行熒光PCR檢測(cè)，58 ℃收集熒光，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，隨后進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析，凝膠成像系統(tǒng)結(jié)果拍照并分析。

1.4 研究方法：瘧疾鏡檢陽性血樣20份，每次檢測(cè)5份，共分為4次檢測(cè)完畢，統(tǒng)計(jì)各份血樣檢測(cè)結(jié)果和每次檢測(cè)時(shí)間，計(jì)算平均用時(shí)。瘧疾鏡檢陰性血樣處理方法同上。統(tǒng)計(jì)瘧疾鏡檢與實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)符合率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析研究數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 瘧疾實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)時(shí)間：瘧疾鏡檢陽性血樣20份，檢測(cè)4次，用時(shí)為18～20 min，平均 （19.15±1.34）min。瘧疾鏡檢陰性血樣20份，檢測(cè)4次，用時(shí)為18～21 min，平均 （19.52±1.49）min。瘧疾鏡檢陰性血樣和瘧疾鏡檢陽性血樣熒光 PCR檢測(cè)時(shí)間無明顯差異P＞0.05，40份血樣熒光PCR檢測(cè)平均用時(shí)（19.34±1.65）min，約為20 min。

2.2 瘧疾實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果與鏡檢比較：瘧疾鏡檢陽性血樣20份中，熒光PCR檢測(cè)陽性20份，熒光PCR檢測(cè)和瘧疾鏡檢符合率為100%（20/20）。瘧疾鏡檢陰性血樣20份中，熒光PCR檢測(cè)陰性為18份，檢出陽性2份，熒光PCR檢測(cè)和瘧疾鏡檢符合率為90.00%（18/20）。在熒光PCR檢測(cè)與瘧疾鏡檢符合率方面，陽性血樣（100%）和陰性血樣（90.00%）比較，無顯著差異P＞0.05，認(rèn)為無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。40份待測(cè)血樣熒光PCR檢測(cè)和瘧疾鏡檢符合率為95.00%（38/40）。

3 討 論

我國(guó)并非瘧疾疫區(qū)國(guó)家，但是近年來我國(guó)勞動(dòng)力輸出增多，較多瘧疾疫區(qū)生活人員往來于我國(guó)境內(nèi)，因而必須有效控制瘧疾的傳入。國(guó)境口岸等單位是負(fù)責(zé)瘧疾檢測(cè)工作的主要部門，需要應(yīng)對(duì)各類瘧疾檢測(cè)，但傳統(tǒng)瘧原蟲形態(tài)檢查、抗體血清學(xué)檢查以及瘧原蟲體抗原檢測(cè)等方法，存在耗時(shí)長(zhǎng)或一次檢測(cè)數(shù)量有限等問題，影響了瘧疾病原體檢測(cè)效率。為此，應(yīng)更為快捷、準(zhǔn)確的瘧疾檢測(cè)系統(tǒng)[2]。

近年來，基因擴(kuò)增技術(shù)趨于成熟，因而應(yīng)探索該方法在瘧原蟲基因檢測(cè)方面的優(yōu)勢(shì)性。為此，本次研究基于各類瘧疾病原體的SSU rRNA基因序列，設(shè)計(jì)了熒光PCR快速檢測(cè)的引物和探針，形成了一套通用型實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測(cè)方法。實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測(cè)時(shí)間較短，本次研究40份血樣熒光PCR檢測(cè)平均用時(shí)（19.34±1.65）min，約為20 min，可知其檢測(cè)速度較快，檢測(cè)效率明顯提升。當(dāng)前，國(guó)內(nèi)對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測(cè)逐漸增多，但是對(duì)于快速檢測(cè)的準(zhǔn)確性仍存在一定的爭(zhēng)議，尚無可靠論據(jù)[3]。本次研究對(duì)比分析了瘧疾鏡檢陽性血樣與陰性血樣的熒光PCR快速檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)鏡檢陽性血樣熒光PCR檢測(cè)和瘧疾鏡檢符合率達(dá)到了100%（20/20），而瘧疾鏡檢陰性血樣20份中，熒光PCR檢測(cè)陰性為18份，熒光PCR檢測(cè)和瘧疾鏡檢符合率為90.00%，瘧疾鏡檢陽性血樣與陰性血樣的熒光PCR快速檢測(cè)結(jié)果無顯著差異，40份待測(cè)血樣熒光PCR檢測(cè)和瘧疾鏡檢符合率高達(dá)95.00%（38/40），可知熒光PCR快速檢測(cè)結(jié)果較為準(zhǔn)確、可靠，提示該快速檢測(cè)方法實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用價(jià)值較高。但是本次研究在對(duì)比陰/陽血樣熒光PCR快速檢測(cè)結(jié)果中也發(fā)現(xiàn)，雖然鏡檢陽性血樣熒光PCR檢測(cè)和瘧疾鏡檢符合率較高，但是瘧疾鏡檢陰性血樣20份中，檢出陽性2份，存在一定的假陽性概率，而無假陰性血樣，提示在熒光PCR快速檢測(cè)中應(yīng)對(duì)陽性病例，再次實(shí)施瘧疾鏡檢，以排除假陽性病例，保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性。當(dāng)前，熒光PCR快速檢測(cè)技術(shù)快速發(fā)展，多數(shù)通用熒光PCR快速檢測(cè)設(shè)備已經(jīng)可以完成1次90份以上的檢測(cè)量，基本可以滿足國(guó)境口岸等單位大規(guī)模檢測(cè)的需求，對(duì)于我國(guó)瘧疾防控工作具有重要意義。

綜上所述，本研究瘧疾病原體實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測(cè)準(zhǔn)確性高，陽性檢出高，檢測(cè)時(shí)間段，用于瘧疾快速檢驗(yàn)可行性較強(qiáng)，不易發(fā)生漏檢情況。

[1] 營(yíng)雅茹,李衛(wèi)東,張?zhí)?等.快速檢測(cè)試劑條、鏡檢和PCR在瘧疾診斷中的應(yīng)用研究[J].中華疾病控制雜志,2014,10(2):163-165.

[2] 祁軍,于智睿,黃吉城,等.交叉引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在惡性瘧疾快速檢測(cè)中的應(yīng)用[J].中國(guó)媒介生物學(xué)及控制雜志,2013,8(3):204-207.

[3] 孫亞維,魯峰,張劼楠.瘧疾Dia Med Opti MAL-IT快速檢測(cè)技術(shù)的臨床應(yīng)用[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2012,5(7):1604-1605.

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1671-8194（2017）07-0017-02