艱難梭菌分子分型方法研究進展

李志榮趙建宏

(1 河北醫科大學第二醫院, 河北 石家莊 050000；2 河北省臨床檢驗中心, 河北 石家莊 050000)

·綜述·

艱難梭菌分子分型方法研究進展

李志榮1, 2趙建宏1, 2

(1 河北醫科大學第二醫院, 河北 石家莊 050000；2 河北省臨床檢驗中心, 河北 石家莊 050000)

艱難梭菌; 分子分型; 分子流行病學

艱難梭菌(Clostridiumdifficile, CD)是一種革蘭陽性厭氧芽孢桿菌，20世紀80年代發現它是引起抗生素相關性假膜性腸炎的原因之一，由其引起的艱難梭菌感染(Clostridiumdifficileinfection, CDI)現已成為抗生素相關性腹瀉的主要原因[1-2]。CDI可表現為從輕度的自限性腹瀉到嚴重的假膜性腸炎甚至死亡。在過去的十多年中，CD的流行病學情況發生了變化，自2004年起在北美和歐洲相繼出現了CD強毒株：NAP-1/027/ST1[3-4]。到2008年，又發現了另一強毒株PCR RT078/NAP 07-08/ST11的傳播流行[5]。快速、準確的分子分型對CD暴發流行的早期監測和追蹤溯源具有重要意義。本文對常用的CD分型方法及其最新研究進展進行綜述。

1 CD分型的歷史回顧

CD常用的分型技術可分為2類：表型分型和基因型分型。血清型分型法是20世紀80年代中期常用的表型分型方法，采用玻片凝集的原理，該方法最初能夠分出6個不同的CD血清型[6]，經進一步改進后可分出15種型別[7]。傳統的其他表型分型方法還包括免疫印跡法分型[8]、細菌素/噬菌體分型[9]、抗菌譜分型[10]等。表型分型方法比較直觀，但是具有重復性低、分型率低和分辨力不足等缺點。20世紀90年代出現基因分型技術，因其具有更好的分型率和分辨力，使之逐步取代表型分型技術[11]。基因型分型技術分為基于電泳條帶和基于序列2種類型。最常用基于電泳條帶型的技術包括限制性內切酶分析(restriction endonuclease analysis, REA)、脈沖場凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)、毛細管或常規PCR核糖體分型(PCR-ribotyping, PCR RT)和多位點可變數目串聯重復序列分析(multiple locus variable-number tandem repeat analysis, MLVA)。近年來被實驗室推崇的基于序列分析的分型技術為多位點序列分型(multilocus sequence typing, MLST)。此外，以序列分析為基礎的全基因組測序技術(whole genome sequencing, WGS)也逐漸興起，成為研究CD菌株之間差異(如單核苷酸多態性分析)的分型技術。

2 常用的CD分型方法

2.1 PCR RT PCR RT是CD最常用的分子分型技術之一。由Gürtler等人首次創建，分型依據是根據16S和23S rDNA之間的間隔區變異性(intergenic spacer region, ISR)[12]。所使用的引物以16S rRNA基因的3’端和23S rRNA基因的5’端保守區為目標設計。因為CD基因組包含多個16S—23S rRNA操縱子，其數量和間隔區大小的不同使得PCR擴增后產生不同的擴增產物，經普通瓊脂糖凝膠電泳分離得到的電泳帶型稱為核糖體型。現在用于CD的PCR RT的引物有兩種[13-14]。其中，Stubbs等人所描述的O’ Neill 引物比Bidet引物的分辨力更好。分辨力是指區分無關菌株的能力，其數據基于辛普森指數(Simpson index, SI)[15]。采用O’ Neill引物進行分型時，PCR產物的大小通常為250～600 bp，然后由瓊脂糖凝膠電泳或最近研究的毛細管電泳分離，從而達到分型目的。在歐洲，PCR核糖型的命名原則是UK(United Kingdom)加三位數的后綴(如UK001)。毛細管電泳核糖型別則為前綴CE加上三位數的后綴(即CE001)。然而，由于PCR核糖體型別的判定需要與參考菌株進行電泳譜型對比，不易在實驗室間統一實現。因此，當前很多實驗室也會依據本實驗室的菌株型別進行排序命名(如本實驗室的型別命名以HB加上兩位數的后綴而成)[16]。迄今為止，PCR RT能夠識別400多種不同的CD類型。

2.2 PFGE分型 在北美地區，PFGE曾是最常用的CD分子分型技術之一。PFGE利用稀有酶切位點限制性內切酶(例如SmaI)對細菌染色體組DNA進行消化，通過在3個不同方向的脈沖電場，從而使細菌DNA片段得以有效分離。由于在電泳過程中的脈沖方向呈線性增加，可以逐步使更大的片段能夠通過凝膠遷移，從而可以區分傳統瓊脂糖凝膠電泳下不能分辨的大片段DNA。PFGE所得到的指紋譜型被稱為NAP型。型別類型使用前綴NAP(北美脈沖場型)后跟一個數字表示脈沖場型的分組和一個字母表示的亞組(即NAP 1b)。

盡管儀器設備昂貴，操作程序復雜和運行緩慢，但在美國PulseNet的大力推動下，PFGE分型方法仍在20世紀90年代成為北美地區大多數CD病原體的金標準。但是，由于細菌DNA的降解導致許多CD無法被分型。此外，PFGE的標準操作流程和應用還需要進一步的優化[17]。

有報道稱PFGE比PCR RT具有更好的分辨力(SI值分別為0.843和0.688)[18]。然而，另一項關于PCR RT初步分型技術比對的研究中，最常見的39個PCR RT型，卻只能被分為16個PFGE類型。所有基于電泳指紋圖譜分型面臨的共同問題是對電泳條帶的識別，尤其是當條帶的譜型差別不大的時候。因此，如何定義PFGE和PCR的不同型別對于識別新的型別非常必要。在歐洲，新的PCR核糖體型別常由參考實驗室來驗證。早期的20個PCR RT型分離自多個歐洲國家，遍布歐洲艱難梭菌感染研究網絡(EuropeanClostridiumdifficileinfection surveillance network, ECDIS-NET)的各參考實驗室[19]。

2.3 MLST分型 MLST于2004年首次用于CD群體構成和全球流行病學研究[20]。該方法是基于基因測序的分子分型方法，通常測序的片段是七個長度約在300 bp和500 bp之間的管家基因(MLST 7HG)。根據每個管家基因的序列變異情況，分配給它一個不同的等位基因編碼，這樣七個等位基因的編碼組合就形成了一個序列類型(ST型)。將MLST分型方法產生的序列數據上傳至一個全球實驗室公用的Web數據庫，即可方便不同實驗室對ST型的確定、研究CD的群落構成和全球流行情況。目前，有2種不同的MLST分型方案[20-21]，這2種分型方案都包括7個管家基因，其中3個基因位點在2個方案中都被應用到(triosephosphate isomerase,tpi; recombinase A,recA; superoxide dismutase A,sodA)。后續研究發現Lemee方案中的丙氨酸連接酶(DDL)位點是一個無效的等位基因，因此應用較少。而Griffiths分型方案則被廣泛應用[21]。據報道，MLST和PCR RT方法的分辨力是相當的[18, 21]。

相比基于電泳指紋圖譜的分型方法(如PCR RT)，MLST更不容易受到基因重組的影響。一個管家基因的重組僅會改變單一基因位點，這使得即便產生了新的ST型，仍會與原始的ST型保持較近的親緣關系，也就維護了系統進化分析的相關性。用MLST進行系統發育分析，可將CD至少分成5個不同的進化分支[21]，而位于第6個分支的菌株可能是單系進化[22]。多數ST型都屬于第一分支，而且這一分支無主要的亞分支。導致這一結果的原因可能與分型方案選擇的管家基因位點相關。選擇不同的管家基因或者在當前的MLST方案中加入新的管家基因，或許可增加對位于第一分支的菌株的分析效果。

基于測序的MLST分型方法的一個主要優勢是其所得出的數據易于解釋。測序的數據比較明確、客觀，具有高度重復性，并易于實驗室間的交流。此外，不同實驗室可將自己的測序數據提交至MLST數據庫。截至2016年1月11日，數據庫中已有可明確的331個ST型。MLST存在的比較現實的缺陷是其測序的成本相對較高，這可能是在許多歐洲實驗室并未用MLST取代傳統的PCR RT的原因之一。

2.4 MLVA MLVA是一種具有高分辨力的分子分型方法，通常被應用于研究細菌暴發流行和追蹤病原體傳播途徑[5, 23-24]。其分型原理是通過軟件尋找散在分布于細菌基因組中的大小不等的短串聯重復序列(VNTR)，并設計相應引物對其擴增，用毛細管電泳自動分析擴增產物。根據其串聯重復序列可變重復數目，分配給不同菌株一定的數組，據此判定為不同的MLVA型別。通過計算匯總串聯重復序列的差異(summed tandem repeat difference, STRD)可構建最小生成樹(minimum spanning tree，MST)。STRD≤2的菌株定義為一個克隆群，STRD≤10的菌種認為是一個基因相關群[5, 25]。Broukhanski等[25]研究發現艱難梭菌MLVA方案中有兩個位點(F3和H9)在不同菌株間沒有差異，表明這兩個位點在CD分型上無任何作用。此外，Bakker等[26]報道，MLVA的A6位點對于PCR RT078是無效位點。因此，對PCR RT078型菌株的分析，需要進一步優化其他幾個位點的PCR設置。目前，MLVA被認為是CD流行病學研究最有效的分型方法，并應用于荷蘭、法國和英國的027型暴發流行研究。還有英國學者采用MLVA方法探討了CDI病例的潛在聯系[27]。值得注意的是，該研究結果顯示，原本被認為是屬于同一種群的菌株，幾乎有一半是由無關菌株組成，或者是由相關和無關的菌株混合組成。

3 艱難梭菌分型方法的新進展

3.1 MLVA進展 有學者提出一個改進的MLVA(modified MLVA, mMLVA)方案，將MLVA與PCR檢測艱難梭菌毒素基因相結合(tcdA,tcdB,cdtB和tcdC)[24]。該方案將MLVA位點數量限定為5個，去除F3和H9位點。盡管結合毒素基因檢測后的分型方案信息量更大，但目前還無法將這些數據與PCR RT027/ NAP01等特定型別相關聯。其原因可能是因為二元毒素基因與tcdC基因缺失的并存現象并不只存于PCR RT027菌株[24, 28]。而在Manzoor等[29]的研究中將MLVA方案所用的基因位點數目增加至15個，擴展后的MLVA(extended MLVA, eMLVA)方案可區分臨床上的主要集群，與PCR RT具有良好的一致性。而僅含有7個位點的MLVA方案[25-26]與PCR RT相關性較差，7個位點MLVA只能結合PCR RT方法作為亞型分型方法使用，而eMLVA則可同時取代兩者。但是，隨著位點數目的增加，該方法也更費力，而且增加了數據的解釋難度。

為創建一個可提供滿意分析的數據，并與PCR RT保持良好的一致性MLVA方案，Wei等[30]篩選了40個MLVA位點用于研究CD暴發流行。研究結果表明，由多樣性較低的等位基因位點組成的MLVA方案與PCR RT相關性高，而多樣性較高的位點組成的分型方案則可用于CD暴發流行研究。這兩個分型方案，分別包括10個多樣性有限的等位基因位點和4個高度多樣性的等位基因位點。

3.2 高分辨毛細管凝膠電泳核糖體分型(capillary gel electrophoresis-based PCR ribotyping， CE-PCR RT) 雖然PCR RT已經被許多歐洲實驗室廣泛應用于CD監測，但是由于指紋圖譜的不易解釋和缺乏標準化數據庫等問題，這一方法的應用傳播仍有較大局限。而CE-PCR RT的應用大大提高了其重復性和可解釋性。例如，傳統的基于瓊脂糖凝膠電泳的PCR RT很難區分014型和020型CD。而CE-PCR RT則不僅可以區分014型和020型，還能將014型進一步分出亞型[31]。美國疾病控制與預防中心(CDC)、加拿大衛生公署、荷蘭萊頓大學醫學中心和英國利茲教學醫院的CD監測，探討了CE-PCR RT的DNA提取、引物設計、PCR循環條件及參考標準等操作流程，并采用標準一致的操作流程對70個不同的RT型進行了檢測[24]。初步結果表明分型結果在不同實驗室之間較為一致。

3.3 基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-light mass, MALDI-TOF MS)分型 MALDI-TOF MS以其在微生物的鑒定、耐藥性和毒力監測中快速、準確、重復性好、高通量等特點，近年來越來越受到人們的關注。它不僅能夠鑒定病原體種/亞種水平，還具有良好的分型能力，逐漸被應用到細菌、真菌和病毒的分型中[32]。其分型原理是建立在MALDI-TOF MS鑒定微生物的基礎上，利用核心圖譜(the main spectra, MSP)建造標準蛋白指紋圖譜庫，采用主成分分析(principal component analysis, PCA)進行數據處理。MALDI-TOF MS質譜圖是以檢測到的離子質荷比(m/z)為橫坐標，離子峰強度為縱坐標構建而成，通過將檢測到的病原體鑒定質譜圖與標準數據庫圖譜比對，從而實現對目標微生物種或菌株的區分和鑒定[33]。圖譜中主要的分子離子峰為菌體內高豐度、表達穩定、進化保守的核糖體蛋白，所以，可以通過聚類分析獲得微生物間的進化和親緣關系。Rettinger等[34]采用MALDI-TOF MS質譜指紋圖譜分型方法、16S rRNA測序方法和MLST方法對28株鉤端螺旋體進行進化分析，發現質譜指紋圖譜能很好地區分高致病性(21株)、中間型(3株)和非致病性(4株)的鉤端螺旋體。與16S rRNA測序方法得到的進化樹結果相同，同一型內各菌株之間相似性很高，但MLST方法卻只能區分中間型鉤端螺旋體，高致病性和非致病性的菌株都歸于一類。目前有研究人員正在探討MALDI-TOF MS在CD分型中的應用[35]。

3.4 二元基因分型 二元基因分型是近年來用于微生物分型的一種新興的分子分型方法，已經成功應用于金黃色葡萄球菌和空腸彎曲桿菌的流行病學研究[36-37]。其分型原理是根據某一個基因在細菌DNA的存在與否，都能將一組細菌分成2個類型，當結合多個這樣的基因位點進行分析時就可將一組細菌進行有效的分型，這樣的基因位點又被稱為二元基因。如果選擇的基因位點是與毒力和耐藥等功能相關的基因時，二元基因分型方法不僅可追蹤流行菌株的傳播途徑，還可讓臨床醫生直觀地了解從患者樣本中分離到菌株的功能基因，以便采取進一步的治療措施。近期，我實驗室成功創建了CD二元基因分型方法，通過方法學對比研究發現，10位點二元基因分型不僅具有操作簡便、費用低、易于分析和數據共享等優點，而且其分辨力也優于核糖體分型和MLST，顯示了良好的應用前景。

3.5 WGS分型 高通量、全基因組測序技術應用的范圍和可靠性已足以準確調查病原體的毒力、流行路徑和菌群結構分布[38]。通過對成百上千的基因組系統發育學和比較基因組學分析，可準確地確定細菌的遺傳學變化，而且容易發現遺傳學與毒力和耐藥性表型的關系，因此，可快速地了解病原體的生物學特征[39]。通過比較單個核苷酸的多態性，WGS可區分菌株間單個核苷酸水平的差別，因此具有極高的分辨力。另外，通過預測病原體出現的選擇性壓力和追蹤病原體流行傳播，WGS在臨床微生物學和公共衛生流行病學領域也有很高的實用價值。

盡管WGS的應用仍然受到設備、數據分析等條件的限制，但該方法代表了病原體分型的終極方法。在未來幾年，WGS將會成為一種常用CDI監測及流行病學工具。雖然與傳統的分型方法相比WGS成本相對較高，但是隨著CD基因組數據質量控制和后期的信息學、系統發育和譜系地理學分析等標準計算程序[40]的發展，WGS數據處理的成本正在迅速下降[12, 41]。此外，1次WGS檢測得出的信息量可同時推斷MLST、PFGE、耐藥基因、毒素基因序列和其他數據，從這個角度來講，它可以平衡成本效益，也預示著它可能是一種終極的分型方法。

首次應用高通量WGS測序技術對PCR RT027系統進化樹研究結果顯示，通過SNP分析可將采集自美國和歐洲的25個PCR RT027菌株進一步分成25不同的基因型。此外，該研究還發現美國和歐洲不同地區的菌株擁有獨特的進化譜系和抗菌藥物耐藥基因。有證據表明[42]，PCR RT027型菌株獲得相同的耐藥突變后出現了兩條不同的流行譜系，這兩譜系在全球傳播時呈現了不同的流行模式。K?ser等[43]的研究將WGS測序在診斷學和流行病學研究中的應用顯示了很好的效果。這項研究指出，基因組SNP分型主要可用于監測暴發和病原菌傳播途徑的識別。當前用于監測CD醫院相關感染暴發的方法，比如PCR RT方法的分辨力有限，不能識別暴發流行的菌株是否來自同一克隆株，而全基因組測序則有很好的分辨力，可以追蹤病原菌在醫院，醫院病房和同一個病房的患者之間的傳播路徑。

Eyre等[44]研究表明，WGS可產生實用的、與臨床直接相關的數據，在一定時間內研究結果有助于患者管理，從而在疾病暴發初期實現感染控制。這項研究中通過WGS檢測發現，由相同ST型CD造成的醫院相關性艱難梭菌感染，實際上可能是一組相互間沒有進化關系的CD所導致，因此可排除其在患者之間傳播的可能。而且，與比較基因組學相結合，WGS是發現與潛在毒力相關的新的遺傳標志的有效方法。這是一個超越傳統分型方法的重要優點，因為傳統方法只能利用現有的菌株特性標記進行分析。

5 未來展望

在過去的15年中，由于基于測序的分子分型方法具有較好的分辨力，以及分型結果的易于解釋和相互交流，使其取代了一些更為傳統的分型方法。而WGS則有可能主導未來十年的分子分型領域。然而，在WGS可作為分子分型的常規方法之前仍需要有更多的研究數據支持。首先，WGS需要在48 h內快速、有效地完成。其次，數據分析等技術流程仍需要進一步簡化。最后，WGS技術的運行和組織平臺成本必須降低。如果滿足這些要求將大大增加WGS在全球的使用，這可能只是一個時間的問題。

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(本文編輯：熊辛睿)

Advances in molecular typing ofClostridiumdifficile

(LI Zhi-rong)1, 2, (ZHAO Jian-hong)1, 2

(1The Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, China； 2 Hebei Provincial Center for Clinical Laboratory, Shijiazhuang 050000, China)

2016-06-15

科技部課題資助項目(2005DKA21202-6)；河北省科技廳資助項目(10966142D)；河北省自然科學基金資助項目(H2013206450)

李志榮(1985-)，男(漢族)，河北省邯鄲市人，主管檢驗師，主要從事臨床微生物致病及耐藥機制研究。

趙建宏 E-mail:zhaojh_2002@yahoo.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2017.04.023

R378.8

A

1671-9638(2017)04-0377-06