線粒體損傷拮抗劑在Cr(Ⅵ)所致肝細(xì)胞凋亡中的保護(hù)作用

朱武暉 王曼

線粒體損傷拮抗劑在Cr(Ⅵ)所致肝細(xì)胞凋亡中的保護(hù)作用

朱武暉 王曼

目的 分析線粒體損傷拮抗劑在六價(jià)鉻［Cr(Ⅵ)］所致肝細(xì)胞凋亡中的保護(hù)作用。方法 通過(guò)肝細(xì)胞培養(yǎng)以及模型的制備獲得受試細(xì)胞, 分為空白對(duì)照組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組, 空白對(duì)照組：不采用Cr溶液處理傳代細(xì)胞, 靜置24 h。模型組：采用4 μM Cr(Ⅵ)單獨(dú)處理24 h。低劑量組、中劑量組、高劑量組：分別在4 μM Cr(Ⅵ)溶液處理后, 采用0.5、1.0、1.5 μM 環(huán)孢霉素A (CsA)干預(yù)。每組試驗(yàn)10次。監(jiān)測(cè)各組細(xì)胞存活率、三磷酸腺苷(ATP)、肝細(xì)胞凋亡率、Caspase-3活性、通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔(PTP)開(kāi)放度、膜電位水平PTP、PTP的ATP、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)、總腺苷酸(TAN)、PTP的ATP/ADP。結(jié)果 五組間細(xì)胞存活率、ATP、肝細(xì)胞凋亡率、Caspase-3活性、PTP開(kāi)放度、膜電位水平PTP、PTP的ATP、ADP、AMP、TAN、PTP的ATP/ADP比較, 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05), 除ATP、PTP的ATP/ADP外, 其余指標(biāo)從模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、空白對(duì)照組存在遞進(jìn)關(guān)系, 高劑量組與低劑量組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論 線粒體損傷拮抗劑在Cr(Ⅵ)所致肝細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了保護(hù)作用。

鉻；肝細(xì)胞凋亡；線粒體損傷拮抗劑

國(guó)際癌癥研究所將鉻確認(rèn)為人類致癌物, 其Cr(Ⅵ)是當(dāng)前毒性最強(qiáng)、致癌性最強(qiáng)的鉻價(jià)態(tài), 在細(xì)胞凋亡啟動(dòng)中發(fā)揮重要作用［1］。理論上線粒體損傷拮抗劑能夠拮抗Cr(Ⅵ)所致線粒體損傷作用［2,3］。本次研究采用細(xì)胞研究, 分析線粒體損傷拮抗劑在Cr(Ⅵ)所致肝細(xì)胞凋亡中的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1. 1 受試細(xì)胞 人胚肝細(xì)胞系L-02(L-02肝細(xì)胞), 來(lái)自上海中科院細(xì)胞培養(yǎng)中心。

1. 2 試劑與儀器 主要包括重鉻酸鉀(基準(zhǔn)級(jí), 含量99.99%以上), ATP, 新生牛血清, 二甲基亞砜, 細(xì)胞凋亡率監(jiān)測(cè)劑。肝細(xì)胞內(nèi)ATP、ADP、AMP含量檢測(cè)試劑, 包括ATP、AMP標(biāo)準(zhǔn)品, 四丁基溴化銨、硫酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸,為分析純。細(xì)胞DNA損傷監(jiān)測(cè)試劑, 正常熔點(diǎn)瓊脂糖等。儀器主要包括HH-CP-T型CO2培養(yǎng)箱, 101-1AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱, 恒溫水浴箱, 酸度計(jì), 自動(dòng)平衡離心機(jī), DYY-Ⅲ型電泳儀, 倒置顯微鏡, 酶標(biāo)儀, 反相高效液相色譜儀等。

1. 3 方法

1. 3. 1 肝細(xì)胞培養(yǎng)以及模型的制備 常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)法獲得L-02肝細(xì)胞, 10%新鮮牛血清培養(yǎng)RPMI-1640培養(yǎng)基, 5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 每隔2～3 d采用0.2% EDTA的0.25%胰酶消化, 傳代1次。采用4 μM Cr(Ⅵ)單獨(dú)處理L-02肝細(xì)胞24 h, 加入MTT, 培養(yǎng)板可見(jiàn)紫藍(lán)色結(jié)晶, 甲臜裂解液溶液,植被模型成功。

1. 3. 2 分組與試驗(yàn) 空白對(duì)照組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組, 空白對(duì)照組：不采用Cr溶液處理傳代細(xì)胞, 靜置24 h。模型組：采用4 μM Cr(Ⅵ)單獨(dú)處理24 h。低劑量組、中劑量組、高劑量組：分別在4 μM Cr(Ⅵ)溶液處理后, 采用0.5、1.0、1.5 μM CsA干預(yù)。每組試驗(yàn)10次。

1. 4 觀察指標(biāo) 監(jiān)測(cè)的主要內(nèi)容包括細(xì)胞存活率、ATP、肝細(xì)胞凋亡率、Caspase-3活性、PTP開(kāi)放度、膜電位水平PTP、PTP的ATP、ADP、AMP、TAN、PTP的ATP/ADP。

1. 5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示, 服從正態(tài)分布兩兩組間比較采用t檢驗(yàn), 多組間比較采用F檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

空白對(duì)照組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組細(xì)胞存活率分別為(0.6780±0.0120)%、(0.5560±0.0150)%、(0.5830±0.0360)%、(0.6110±0.0150)%、(0.6353±0.0340)%, ATP分別為(0.769±0.045)、(0.583±0.025)、(0.573±0.018)、(0.584±0.024)、(0.673±0.053), 肝細(xì)胞凋亡率分別為(2.275± 0.011)%、(22.535±0.963)%、(18.461±0.495)%、(17.563± 0.361)%、(14.762±0.438)%, Caspase-3活性分別為(0.436± 0.001)、(0.652±0.032)、(0.631±0.105)、(0.583±0.132)、(0.525± 0.112)×106U/mgpro, PTP開(kāi)放度分別為(53.204±1.535)、(23.003± 1.433)、(25.634±3.296)、(29.571±4.613)、(35.681±4.312),膜電位水平PTP分別為(40.708±2.143)%、(67.536±0.725)%、(61.540±1.864)%、(55.572±1.209)%、(51.510±1.646)%, PTP的ATP分別為(7.733±0.083)、(2.126±0.028)、(3.170±0.143)、(4.574±0.104)、(5.546±0.086)μg/106cells, ADP分別為(2.127± 0.125)、(0.635±0.043)、(0.725±0.356)、(0.956±0.056)、(1.478± 0.074)μg/106cells, AMP分別為(0.745±0.065)、(0.637±0.026)、(0.674±0.044)、(0.695±0.032)、(0.710±0.048)μg/106cells, TAN分別為(10.576±0.157)、(3.345±0.054)、(3.574±0.086)、(5.466±0.115)、(7.673±0.125)μg/106cells, PTP的ATP/ADP分別為(3.636±0.462)、(3.348±0.325)、(4.372±0.304)、(4.785± 0.298)、(3.752±0.431)。五組間細(xì)胞存活率、ATP、肝細(xì)胞凋亡率、Caspase-3活性、PTP開(kāi)放度、膜電位水平PTP、PTP的ATP、ADP、AMP、TAN、PTP的ATP/ADP比較, 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05), 除ATP、PTP的ATP/ADP外,其余指標(biāo)從模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、空白對(duì)照組存在遞進(jìn)關(guān)系, 高劑量組與低劑量組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 小結(jié)

從本次研究來(lái)看, Cr(Ⅵ)確實(shí)可能加速肝細(xì)胞凋亡, 這可能與其細(xì)胞的膜電位水平、PTP開(kāi)放等作用的調(diào)節(jié)作用有關(guān)［4］。本次低劑量組、中劑量組、高劑量組采用CsA處理后,對(duì)象的各項(xiàng)指標(biāo)更趨近于空白對(duì)照組, 各組之間存在遞進(jìn)關(guān)系, 提示使用CsA能夠?qū)笴r(Ⅵ)引起的生物化學(xué)改變, 從而減輕肝細(xì)胞損傷［5,6］。CsA主要通過(guò)保護(hù)肝細(xì)胞線粒體膜完整性, 維持粒細(xì)胞功能等作用, 從而抑制Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡［7,8］。

［1］ 張蕾, 于鋒. 肝細(xì)胞線粒體凋亡途徑及保護(hù)機(jī)制研究進(jìn)展. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2014, 14(3):586-589.

［2］ Wu S, Duan N, Shi Z, et al. Simultaneous aptasensor for multiplex pathogenic bacteria detection based on multicolor upconversion nanoparticles labels. Analytical Chemistry, 2014, 86(6):3100-3107.

［3］ Dai Y, Kang X, Yang D, et al. Platinum (Ⅳ) Pro-Drug Conjugated NaYF4:Yb3+/Er3+ Nanoparticles for Targeted Drug Delivery and Up-Conversion Cell Imaging. Advanced Healthcare Materials, 2013, 2(4):562-567.

［4］ Liu X, Zheng M, Kong X, et al. Separately doped upconversion-C60 nanoplatform for NIR imaging-guided photodynamictherapy of cancer cells. Chem Commun (Camb), 2013, 49(31):3224-3226.

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［6］ 楊婷婷, 江振洲, 張陸勇. 經(jīng)由線粒體損傷誘發(fā)的藥源性肝損傷研究進(jìn)展. 藥學(xué)進(jìn)展, 2014(11):809-818.

［7］ 蘇苗, 俞騰飛, 郭敏, 等. 肝細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究進(jìn)展. 中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志, 2015(16):1684-1686.

［8］ 劉林, 成揚(yáng), 胡義揚(yáng). 線粒體損傷在脂肪性肝病發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制研究進(jìn)展. 中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志, 2014(3):182-185.

Protective effects of mitochondrial damage antagonists on hepatocellular apoptosis induced by Cr (VI)

ZHU Wu-hui, WANG Man. Department of Hepatobiliary Surgery, Qingdao Third People's Hospital, Qingdao 266041, China

Objective To analyze the protective effects of mitochondrial damage antagonists on hepatocellular apoptosis induced by hexavalent chromium ［Cr (Ⅵ)］. Methods The cells were obtained by hepatocyte culture and preparation of the model, and they were divided into blank control group, model group, low-dose group, middle-dose group and high-dose group. The blank control group

no performance of Cr solution for passage cells, and remained for 24 h. The model group received 4 μM Cr (Ⅵ) alone for 24 h. low-dose group, middle-dose group and high-dose group respectively received 0.5, 1.0 and 1.5 μM cyclosporine A(CsA) intervention after process of 4μM Cr (Ⅵ) solution. Each group was tested for 10 times. Monitoring were made on cell survival rate, adenosine triphosphate (ATP), liver cell apoptosis rate, Caspase-3 activity, permeability transition pore (PTP) opening degree, the level of membrane potential PTP, ATP of PTP, adenosine diphosphate of PTP (ADP), adenosine monophosphate (AMP), total adenylate (TAN), ATP/ADP of PTP in groups. Results There were statistically significant difference in cell survival rate, ATP, liver cell apoptosis rate, Caspase-3 activity, PTP opening degree, the level of membrane potential PTP, ATP of PTP, ADP, AMP, TAN and ATP/ADP of PTP (P＜0.05). In addition to ATP, ATP / ADP, the remaining indicators had progressive relationship from the model-group, low-dose group, middle-dose group, high-dose group, blank control group, and there was statistically significant between high-dose group and low-dose group. Conclusion Mitochondrial damage antagonists shows protective effect on hepatocellular apoptosis induced by Cr (Ⅵ).

Chromium; Hepatocellular apoptosis; Mitochondrial damage antagonists

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2017.15.112

2017-05-12］

266041 青島市第三人民醫(yī)院肝膽外科