從豬主動脈中制備脫細胞基質(ECM)的實驗研究

薛錦儒,馮永剛,王圖慧,韓春山

(吉林大學中日聯誼醫院，吉林 長春130033)

*通訊作者

從豬主動脈中制備脫細胞基質(ECM)的實驗研究

薛錦儒,馮永剛,王圖慧,韓春山*

(吉林大學中日聯誼醫院，吉林 長春130033)

脫細胞基質亦名細胞外基質(ECM)是廣泛存在于動物組織器官中的纖維組織，主要由Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ型膠原，絲蛋白，纖維素和殼聚集糖等物質構成，包括取自小腸的SIS和取自膀胱的UBM[1,2]。由于ECM不存在細胞成分，因此沒有免疫原性，這是用ECM構建組織器官的前提條件之一。同時ECM來源的組織不同，其所攜帶的生物信息也不同，在構建組織器官時，相同胚層起源的組織所攜帶的生物信息相近，對于恢復新建組織器官的功能更為有利。國內外廣泛應用ECM修復、重建組織器官，尤其在組織工程領域，ECM是極佳的組織支架材料，為種子細胞的生長提供了良好的基礎[3,4]。與消化道、呼吸道重建不同，用ECM重建心血管器官具有一定的特殊性：①ECM要更堅固，在重建的主動脈或左心室上要承受較大的壓力；②光滑度要求更高，以防止附壁血栓的形成；③邊緣要有足夠的韌度，以免縫合時邊緣縫針處撕裂，造成漏血。我們從豬的主動脈中成功制取了ECM，并用此種ECM修復左心室，同時以豬小腸中制取的SIS進行對照研究。

1 材料與方法

1.1 豬主動脈ECM的制取

地產白豬10頭，體重100-150 kg，本市屠宰場獲取，缺血時間在20 min以內，取出后立即浸入4℃生理鹽水中，并以生理鹽水洗凈。將主動脈平整鋪在操作臺上，側面剪開，以眼科剪刀仔細剪開主動脈內膜，盡可能多地剪開小口，將主動脈內膜分塊剔除。肋間動脈開口處以11號手術刀片仔細刮除內膜以防止細胞殘留。將主動脈翻轉，以眼科剪刀剪除主動脈外膜，中層平滑肌上剪開盡可能多的小口，以有機玻璃板仔細刮除平滑肌層，保留完整的豬主動脈ECM。將豬主動脈ECM三層折疊、雙面以玻璃加壓，使其緊密相貼，真空干燥。

1.2 豬小腸SIS的制取

在切取主動脈的同時，取同體豬小腸50 cm，取出后立即浸入4℃生理鹽水中，洗凈腸內容。將小腸按10 cm長度剪成段，平整鋪在操作臺上，側面剪開，以眼科剪刀仔細剪開小腸黏膜，盡可能多地剪開小口，將腸黏膜刮除。將小腸翻轉，以眼科剪刀剪開漿肌層，仔細刮除漿肌層，保留白色、半透明、菲薄的SIS。將豬小腸SIS三層，以前述之方法折疊、加壓、干燥。

1.3 動物實驗研究

地產白豬10頭，體重35±3.9 kg,分為兩組，ECM組5頭，SIS組5頭。肌注Ketamine(1 mg/kg)誘導麻醉，心電監測，血氧飽和度監測。胸部正中切口，劈開胸骨，剪開心包，顯露心臟。右心房注射肝素200 U/kg體重，主動脈和右心房分別插管，接人工心肺機并行循環。左冠狀動脈第二對角支以6號Proline線縫扎，造成左室前壁小區域心肌梗死。根據心梗范圍，修剪ECM/SIS補片使其大小與梗死范圍相符，將補片預縫4-0 Proline 線8針。以11號刀片切除左室前壁梗死區，將補片縫在左室缺損處，針從心腔內縫出，加墊片在心外膜結扎。停止人工心肺機并行循環，拔除主動脈和右心房插管，胸骨后放置引流，關胸。術后抗菌素(頭孢氨芐30 mg/kg)預防感染，次日拔除胸骨后引流管，術后觀察一個月處死存活動物。

2 結果

ECM組3例動物順利完成手術并存活一個月，1例術中死于心室纖顫，另一例術后一周死于心力衰竭。SIS組2例順利完成手術，2例于術中出現SIS補片縫合緣漏血，死于失血性休克。1例存活至術后5天，活動中出現SIS補片破裂而猝死。

存活到一個月的5例動物，以靜脈注射氯化鉀的方式處死。切取心臟左室補片部位，HE染色，光鏡下觀察：兩組左心室補片與左心室心肌結合部位連接致密，無漏血現象；心肌細胞已經沿著補片邊緣向中心生長，ECM組自邊緣向中心生長3.53±0.21 mm；SIS組自邊緣向中心生長2.1±0.31 mm (P<0.05)。

3 討論

脫細胞基質(ECM)攜帶原有器官的生物信息已經為國外的研究所證實[5]，這些生物信息儲存在膠原和纖維當中，與胚胎起源有關，也與組織器官的生物進化和功能訓練有關，譬如取自小腸的SIS，用其修復需要蠕動的器官更有優勢。取自主動脈的ECM,用其修復心臟或大血管更佳。

比較兩種補片的堅固性，取自主動脈的ECM較之取自小腸的SIS更為堅固，前者未出現破裂現象，后者則出現一例。在補片邊緣縫針部位的堅固程度來看，ECM補片更堅韌，縫針處無裂傷，SIS補片邊緣縫針處出血明顯，2例因出血而死。說明同為三層的脫細胞基質，制備工藝完全相同的情況下，在耐受壓力和堅韌程度上，SIS補片均遜于ECM補片。而在兩種補片誘導心肌細胞爬行生長方面，ECM補片明顯優于SIS補片，細胞在其表面生長的速度更快，說明在修補心血管時宜采用取自主動脈的ECM。

[1]李春霖，薛錦儒，吳金鳳，等.豬天然管狀SIS人工食管的制備和不同滅菌方式的比較[J].中國實驗診斷學，2013，17(1)：15.

[2]Piccoli M,Urbani L,Alvare-Fallaas ME.Improvement of diaphragmatic performance through orthotopic application of decelluarized extracellular patch[J].Biomaterials,2016，74:245.

[3]李春霖，薛錦儒，崔建華.豬小腸與犬食管脫細胞基質(ECM)構建組織工程化人工食管的比較研究[J].中國實驗診斷學，2013,17(2)：207.

[4]吳金鳳，薛錦儒，崔建華.用豬小腸細胞外基質膜(ECM)修復家兔缺損胸壁的實驗研究[J].中國實驗診斷學，2011，15(10):1643.

[5]崔建華，郝 斌，孟曉萍.豬多層細胞外基質(ECM)人工食管的動物實驗研究[J].中國實驗診斷學，2009,13(2)：173.

1007-4287(2017)03-0484-02

2016-07-14)