腫瘤壞死因子β及其相關疾病的研究進展

孫亞薇，白志超，朱秋雨，常玉梅

腫瘤壞死因子β及其相關疾病的研究進展

孫亞薇，白志超，朱秋雨，常玉梅

腫瘤壞死因子（TNF）超家族由 19 個成員組成，多數成員與相應受體結合為三聚體形式激活下游信號通路轉導，從而參與一系列炎癥和免疫反應。在腫瘤壞死因子超家族成員中，研究最為深入和廣泛的是腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor α，TNFα），它與強直性脊柱炎、類風濕性關節炎、炎癥性腸炎、多發性硬化、銀屑病、急性肝炎等疾病的發生具有重要關系[1-2]。腫瘤壞死因子 β（tumor necrosis factor β，TNFβ）是腫瘤壞死因子超家族的另一重要成員，可以膜結合形式（LTα1β2）或者游離形式（LTα3）存在[3]。和 TNFα 相似，游離形式的 TNFβ（LTα3）通過與腫瘤壞死因子 I 型受體（tumor necrosis factor receptor I，TNFRl）和腫瘤壞死因子 II 型受體（tumor necrosis factor receptor II，TNFR2）結合從而介導大部分信號轉導，其激活后和TNFα 有某些共同的生物活性，其中最主要的是激活經典和非經典的 NF-κB 級聯信號轉導途徑[4]。TNFβ 有廣泛的生物活性，從調控二級淋巴器官的發育到調節對于特定微生物的免疫反應等過程都發揮了重要作用[5]。TNFβ 主要表達在CD4+I 型 T 輔助細胞（T helper cell 1，TH1）、CD8+細胞、NK 細胞、B 細胞和巨噬細胞。它在免疫系統的發生、發展和功能方面有特殊作用，尤其是在淋巴器官的發展，淋巴微環境的維持，宿主防御以及炎癥方面有著非常重要的作用[6]。然而，許多證據指出這些作用來自基因缺陷小鼠，與人類本身 TNFβ 的相關性并不是十分明確。而且，這些動物模型使得確定 TNFβ 在以上這些系統中發揮的作用變得比較困難。這是由于 TNFβ 基因與 TNFα 基因、LTβ 基因密切相關聯，并且靶向 TNFβ 基因可以導致旁系基因的損害[7]。而且，TNFβ 可以在一定程度上控制 TNFα 的表達，TNFβ 的缺失可以干擾 TNFα 的產生。同一種細胞類型可同時表達 TNFα 和 TNFβ，敲除兩種細胞因子中任何一種基因的小鼠都可以表現出不同的表型特征，表明這兩種細胞因子有著相似但又不同的功能。

1 腫瘤壞死因子 β 的信號轉導途徑

人的 TNFβ 位于 6 號染色體短臂 2 區 1 帶，TNFβ以形成同源三聚體的形式和其受體結合，引發膜上受體的三聚化，進而引發下游一系列信號傳導通路的激活。TNFβ 三聚體結合到其受體的胞外區后，腫瘤壞死因子受體相關死亡蛋白（tumor necrosis factor receptor associated death protein，TRADD）通過自身 C 端死亡結構域和 TNFRI 的死亡結構域結合，形成 TNFRI/TRADD 復合體，隨后激活 Fas 相關死亡蛋白（Fas associated death protein，FADD），然后通過其死亡結構域和 Fas 相關死亡結構域蛋白樣白介素 1β 轉化酶（Fas associated death domain protein like interleukin 1β converting enzyme，FLICE）的死亡結構域相結合，進而激活下游的 caspase-3 和 caspase-9，最終導致細胞凋亡。進一步研究發現激活的 FLICE 能直接促使細胞色素 C 從線粒體釋放到胞質，引發 caspase 活化級聯反應，導致細胞死亡。在腫瘤壞死因子與其受體結合激活下游信號通路過程中，受體相互作用蛋白（receptor-interacting protein，RIP）和 TRADD 通過各自的死亡結構域相互連接，誘導細胞壞死或者凋亡[8]。

2 腫瘤壞死因子 β 所致疾病

2.1 腫瘤壞死因子 β 與類風濕性關節炎

許多研究表明，TNFα 在多種疾病的發生發展過程中均發揮了重要作用，有文獻表明有幾種不同類型腫瘤細胞組成型表達 TNFα，其中包括卵巢癌、乳腺癌等[9]。TNFα 在多種肺部疾病中也起到了很重要的作用，例如哮喘、慢性支氣管炎、慢性阻塞性肺疾病、急性肺損傷以及急性呼吸窘迫綜合征等都有 TNFα 參與[10]。TNFα 還參與了自身免疫性疾病的發生發展。眼葡萄膜炎、多發性硬化、系統性紅斑狼瘡以及克羅恩病的發生與多種腫瘤壞死因子超家族成員或者其受體的功能紊亂相關聯[11]，阻斷 TNFα 對于治療骨關節炎以及克羅恩病都有顯著效果。但關于 TNFβ 的研究則較少，近年研究發現它可能在類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）中發揮了至關重要的作用。RA 是一類以關節損傷為主要特征的慢性免疫性疾病，TNFα 在改善 RA的過程中發揮了重要作用，阻斷 TNFα 對于治療 RA 病人非常有效[12]。然而，相當一部分病人對于抗 TNFα 治療并不敏感并且出現了抵抗[13]。有報道，其他細胞因子參與到了 RA 的發生和發展，這可能導致了患者對于抗 TNFα 治療的不敏感。通過對 RA 病人的樣本進行酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、RT-PCR以及免疫組化分析得出 TNFβ 可能參與到了 RA 的發生發展過程中。報道發現，和骨性關節炎對照組相比，RA 病人血清和關節滑膜組織中的 TNFβ 水平顯著升高[14-15]，并且單純用特異性 TNFα 阻斷劑英夫利昔治療 RA 病人未見明顯的臨床療效，后續對同一病人應用 TNFR2-Fc 融合蛋白伊納西普治療，同時阻斷 TNFα 和 TNFβ，結果發現其病情有所緩解，這進一步表明了 TNFβ 和 RA 的關聯性[16]。近來，Calmon-Hamaty 等[17]證明了在刺激 RA 發病的成纖維細胞樣滑膜細胞增生過程中，TNFβ 和 TNFα 幾乎發揮了同樣重要的作用。用伊納西普抑制兩者的作用后，刺激指數均明顯下降。另外，TNFβ 可以使 MAPK 下游信號通路中的 ERK、p38 發生磷酸化而激活，從而引起下游信號通路的激活，并最終導致了 RA 的發生。

2.2 腫瘤壞死因子 β 與移植物抗宿主病的發生

研究發現，TNFβ 還參與了移植物抗宿主病（graft-versus-host disease，GVHD）的發生和發展，所謂移植物抗宿主病，是由于移植物組織中的免疫活性細胞與組織不相融性抗原受者組織之間發生的免疫反應，可導致受者皮膚、肝臟和消化道細胞壞死，嚴重者可引起廣泛的腸道黏膜和皮膚脫落，對真菌和細菌感染的易感性增高，從而發生致命性感染。GVHD 是骨髓移植的主要障礙，也是骨髓移植后主要并發癥和死亡原因。2010年，Markey 等[18]發現可溶性的 TNFβ 在 GVHD 的過程中是不可或缺的分子。他們的研究發現在 TNFα 缺失的情況下，TNFR-Fc 嵌合受體仍可以對 GVHD 有一定的保護作用，說明在 GVHD 的發生過程中，還有其他細胞因子在發揮著作用。將 TNFβ 敲除的 B6 鼠的骨髓移植到 BALB/c 小鼠體內后，發現移植TNFβ 敲除鼠的實驗組存活率更高，發生 GVHD 的機率大大降低，這提示供者來源的細胞產生的 TNFβ 是 GVHD發生的重要原因之一。Chiang 等[19]發現在 GVHD 的異體基因移植模型中，TNFβ 上調激活人類供者的淋巴細胞，并且靶向敲除這些供者細胞能夠改善 GVHD 的發生情況。MLTA3698A 是一個能夠特異性中和可溶性和膜結合型TNFβ 的單克隆抗體，在體外可以發揮抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用（antibody-dependent cellularcytotoxicity，ADCC）。利用 GVHD 的人源化 SCID（Hu-SCID）小鼠模型，MLTA3698A 特異性清除了供者 TNFβ 陽性表達的 T、B 淋巴細胞，從而延長了小鼠的生存期。這些研究為免疫性疾病如 GVHD 甚至是自身免疫性疾病的治療都提供了一些依據。

2.3 腫瘤壞死因子 β 與其他疾病發生發展之間的關系

有研究表明，TNFβ 通過 TNFR 介導了派爾集合淋巴結的形成[20]，其依據是 TNFR-/- 小鼠的派爾集合淋巴結完全缺乏或者不正常，而 TNFα-/- 的小鼠卻有正常的派爾集合淋巴結[21]。有些文獻表明，TNFβ 在對抗特定感染方面起到了一定的宿主防御作用，比如 TNFβ 缺陷的小鼠對金黃色葡萄球菌高度易感[22]。Pamir 等[23]分別用高脂肪高糖飲食飼喂野生型小鼠和 TNFβ-/- 小鼠，結果發現，在 13 周的高脂肪高糖飲食后，和野生型小鼠相比，TNFβ-/- 小鼠體重降低 20%，并且糖耐量提高，表明野生型小鼠中 TNFβ可能參與損害糖代謝過程。Zhang 等[24]研究表明 TNFα 和TNFβ 的過度表達分別導致了急性心肌梗死后的早期和晚期的心臟功能紊亂，并且TNFα 和 TNFβ 介導的這種心肌梗死后心臟功能紊亂均是通過 TNFR1 來發揮作用，而TNFR2 的激活則具有心肌保護作用。Veiga-Parga 等[25]發現單純皰疹病毒 1 感染眼部可導致基質角膜炎的發生，TNFβ在這種角膜炎的發生中起到了重要作用。研究發現，感染后48 h，TNFβ 轉錄水平顯著提高。利用角膜的基質成纖維細胞系進行實驗，發現 TNFβ 通過激活細胞因子的產生促進炎癥的發生。提前用抗 TNFβ 單克隆抗體中和小鼠的TNFβ 顯著減輕了角膜損害。

3 腫瘤壞死因子抑制劑研究現狀

3.1 大分子抑制劑

目前為止，已有三種針對腫瘤壞死因子的大分子抑制劑被美國 FDA 批準上市，其中，英夫利昔單抗是第一個批準上市的抗 TNFα 的藥物，自 1998年首次應用于臨床以來，已經成為治療風濕性關節炎等炎癥性疾病的首選藥物。另外，還有一些抗 TNFα 的單克隆抗體，如 2003年批準上市的阿達木單抗，以及 2009年上市的戈利木單抗等。然而，這些大分子抑制劑出現了許多不良反應，如惡性腫瘤，細菌、病毒和真菌引發的感染，藥物的免疫反應，皮膚的過敏反應等。隨著腫瘤壞死因子大分子抑制劑出現的這些不良反應逐漸顯現，研究開始聚焦于靶向腫瘤壞死因子信號通路的小分子化合物。它們具有一些潛在的優勢，如減少免疫抑制、提高組織穿透力、易于工業化生產、成本較低等。

3.2 小分子抑制劑

除了上述的大分子抑制劑外，目前，也有一些針對腫瘤壞死因子下游信號通路中某些分子的小分子抑制劑的研究，例如在 RA 的治療過程中，有一種稱為緩解病情抗風濕藥（disease-modifying anti-rheumatic drug，DMARDs）的小分子二線藥物，由于其分子靶點和免疫調節機制還不清楚，很多研究便轉到靶向特異性信號通路或擾亂細胞激活機制的小分子抑制劑（small molecular inhibitors，SMIs）上來[26]，如 p38 抑制劑便是靶向特異性信號通路的一種小分子抑制劑。研究發現缺乏 p38γ 和 p38δ 的復合物顯著地降低了膠原誘導的關節炎和炎癥分子前體的表達，這些炎癥分子包括白細胞介素-1 和 TNFα 等，然而這也只是發揮了中介的抑制效果，并未從根本上抑制這些炎癥細胞因子的產生[27]。有大量積累研究指出在 p38 的所有同型異構體中，p38α 可能是最重要的炎癥應答因子。許多有效的具有抗炎活性的p38α 抑制劑被開發出來，并且其中至少有 22 種已經進入了 I/II 期臨床試驗用于自身免疫性疾病的治療。然而由于極其有限的臨床效果和潛在的毒副作用，例如肝毒性、嚴重感染的發生、胃腸功能紊亂以及中樞神經系統功能紊亂等，使得這些藥物未進入到 III 期臨床試驗便宣告終止[28-31]。雖然 p38 抑制劑在治療類風濕性關節炎的過程中以失敗告終，但它們在治療其他疾病時卻有比較好的醫學價值。

在導致 MAPK 和 NF-κB 信號通路激活的前體炎癥分子中，JAKs 家族成員，包括 JAK1、JAK2、JAK3 和Tyk2[32]發揮了關鍵的作用。托法替尼是靶向特異性信號通路小分子抑制劑的又一個代表，它是靶向 JAKs 家族的一種特異性小分子抑制劑。托法替尼能顯著地改善 RA 病人的癥狀而且能夠提高病人的生理功能[33]。2012年11月6日，美國食品和藥物管理局（FDA）通過危險評估和減輕策略（risk evaluation and mitigation strategy，REMS）批準了 JAK 抑制劑托法替尼用于治療成人活動期以及對甲氨蝶呤反應不佳的中至重度 RA 患者，但其特異性比較差，不良反應仍然較大。

近些年來尋找更安全和有效的小分子抑制劑的工作依舊繼續，小分子抑制劑的潛在靶分子也逐漸被報道出來。有文獻報道，通過計算機虛擬篩選結合藥物設計的方法，發現一個小分子化合物—— (E)-4-(2-(4-chloro-3-nitrophenyl)，其能夠和 TNFα 直接結合，而且能抑制 TNFα 下游信號通路的激活[34]。還有一種 TNFα 轉化酶（TNFα converting enzyme，TACE）的藥物，它是一種鋅依賴的特異性基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP），能夠將膜結合型的腫瘤壞死因子剪切變為游離狀態。轉錄后，腫瘤壞死因子先被翻譯成一個前體蛋白，此蛋白含有一段較長的信號肽序列，幫助其固定在細胞外側膜上。在發生炎癥反應時，TACE 行使其切割功能產生可溶型腫瘤壞死因子。馬馬司他是廣譜的 TACE 和基質金屬蛋白酶抑制劑，能夠抑制脂多糖介導的可溶型腫瘤壞死因子的表達，從而發揮抑制作用。然而膜結合型腫瘤壞死因子在多種疾病的發生發展過程中也有重要作用，故而單一靶向抑制 TACE 的藥物也有其局限性。

4 結束語

研究人員曾認為 TNFβ 的作用次于 TNFα，因此與其有關的研究非常少，然而近年來很多研究都證明了 TNFβ在許多疾病的發生中都有很重要的作用。目前只有很少一部分抑制 TNFα 作用的受體樣大分子藥物在抑制 TNFα 的同時也能夠抑制 TNFβ 的作用，例如伊納西普，它是由人IgGl 的 Fc 段和 TNFR2 胞外部分二聚體組成的一個融合蛋白，能夠同時抑制兩者的功能。雖然大分子藥物具有某些明顯的優勢，比如臨床療效明顯、半衰期長、靶向性強等，然而亦有很多難以改進的缺點，經常有文獻報道這些大分子藥物由于免疫原性強導致機體免疫損害，另外還可導致感染、腫瘤等，其中不良反應發生率最高的表現為感染。Raychaudhuri 等[35]發現，感染率升高與這些大分子抑制劑的應用密切相關。另外，感染的類型多種多樣，例如球孢子菌病、機會感染以及結核病等。因此，研發特異性針對 TNFβ的小分子抑制劑變得十分重要。

在臨床使用中，各類腫瘤壞死因子的小分子抑制劑對RA 以及其他慢性炎癥反應性疾病表現出了較好的應用前景，功能方面也有很多差異，因此希望研制出更加安全并且有效的腫瘤壞死因子抑制劑，同時擴展藥物的適應證也是研究的重點。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2017.04.013

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071000 保定，解放軍二五二醫院中心實驗室

常玉梅，Email：centerlab252@163.com

2017-06-05