體外組織培養法保存關節軟骨的研究進展

韓運寧，亓建洪

體外組織培養法保存關節軟骨的研究進展

韓運寧，亓建洪

同種異體軟骨移植是成功治療大面積關節軟骨缺損的一種選擇。大量研究報道，異體骨軟骨移植后軟骨移植物的存活率較高，10 年存活率在 71% ～ 85% 之間，15 年存活率高達 74%，20 年存活率可以達到 66%[1]。相對于關節置換手術，同種異體軟骨移植術后的患者恢復快、效果好。運動人群中 88% 的病人可重新運動，其中 79% 的病人可以恢復到受傷前的運動水平[2]。總體來說，同種異體骨軟骨移植治療已經取得很好的效果。然而，在保存期間軟骨細胞生物活性的降低限制了同種異體軟骨移植的應用。有研究發現保存 7 d 內的軟骨細胞活性最適合應用于臨床，超過這個時間軟骨細胞活性明顯降低[3-4]，當移植物細胞存活率低于70% 時，手術效果很不理想[5]。而異體軟骨在移植到患者之前需要經歷移植物的轉運、病原檢查等必要步驟，至少需要 1 ～ 2 周的時間。因此延長體外軟骨的保存時間，并維持其原有的生物學、生物力學特性，對于擴大軟骨移植臨床應用與提高移植效果尤為重要，也是同種異體軟骨移植手術成功與否的關鍵。目前體外軟骨保存的方法有冷凍保存法、組織培養法等。有實驗研究顯示組織培養法的保存效果要優于冷凍保存法[6-8]，且保存時間最長可達 60 d[9]。因此如何進一步地提高組織培養法保存軟骨的效果成為研究的熱點及難點，本文主要從軟骨保存液的成分和保存環境兩個方面綜述，以尋求更理想的保存方法。

1 保存環境

1.1 保存溫度

目前組織培養法保存關節軟骨常用的保存溫度為 4 ℃、37 ℃ 和 25 ℃。4 ℃ 條件下可以減緩軟骨細胞的代謝，維持原有的細胞外基質成分。LaPrade 等[10]在 4 ℃ 條件下保存軟骨 28 d，細胞存活率可以達到 70% 的閾值。Qi 等[11]采用每兩天換一次培養液的方法保存軟骨，實驗結果顯示4 ℃ 條件下的保存效果優于 37 ℃ 條件下的保存。有研究人員模擬軟骨細胞生存的生理溫度，即在 37 ℃ 條件下保存軟骨。Garrity 等[12]用一種無血清的保存液在 37 ℃ 下保存狗的膝關節軟骨 56 d，軟骨細胞存活率可以達到 70%。相比 4 ℃ 下保存，軟骨細胞存活率有了明顯的提高。但是黏多糖、膠原蛋白含量和生物力學性能與 4 ℃ 下保存效果相比沒有明顯差異。Pallante 等[13]研究發現，37 ℃ 保存軟骨 28 d 后檢測軟骨細胞存活率，軟骨表面的細胞存活率可達 80%，淺層區域為 65%，中層為 70%。而該實驗中 4 ℃保存條件下的細胞存活率分別只有 45%、20%、35%。Cook等[9]在室溫下，即在 25 ℃ 下用 MOPS 保存液保存羊關節軟骨獲得了理想的結果。由于保存液的成分和實驗條件的不同，4 ℃、37 ℃ 和 25 ℃ 下的保存效果尚存在爭議，需要根據自己的實驗條件選擇合適的保存溫度。

1.2 換液頻率

組織培養法保存軟骨與培養細胞類似，需要定期更換培養液。保存軟骨時多采用 2 d 更換一次培養液的方式來為體外軟骨提供足夠的營養，維持其基本代謝[11]。但換液頻率對保存效果的影響尚沒有相關的研究。

1.3 應力環境

正常的軟骨在體內會受到周期性應力的作用，有利于軟骨細胞吸收關節液中的營養物質。組織培養法保存軟骨與體內軟骨相比缺乏必需的應力刺激，影響軟骨細胞的正常代謝。Diao 等[14]發現，動態循環的壓力刺激可以使調控軟骨生成的基因 SOX9 表達升高，同時降低軟骨細胞的代謝。楊健等[15]以一種非接觸性的力學加載形式作用于液體保存中的軟骨，對細胞外基質結構產生積極的作用。但是不同強度的壓力對軟骨細胞產生的作用不同，不合適的壓力會對軟骨細胞的增殖和凋亡產生負性作用[16]。以上實驗表明適當的應力刺激對軟骨細胞會產生積極的作用，因此軟骨保存所需的應力環境也是今后組織培養法保存關節軟骨方案的優化方向。

2 保存液成分

隨著各種器官及組織移植技術的迅速發展，各國研究人員對組織培養液的研究越來越多。軟骨的組織培養液有很多種類，其中常用的組織培養液有最低必需培養液（Eagle's minimum essential medium，EMEM）、Iscove’s 改良培養液（IMDM）、Dulbecco’s 改良 Eagle 培養液（DMEM）、威斯康星大學液（UW 液）、RPMI1640 培養液以及乳酸林格液等。培養液的成分成為影響保存效果的重要因素，研究人員通過對已有培養液進行處理，加入血清、蛋白、生長因子、細胞凋亡抑制劑、抗氧化劑等，使得軟骨保存的效果得到了提升。

2.1 血清

血清中含有豐富的細胞生長必需的營養成分，在細胞培養和軟骨組織的保存中都有應用。Pennock 等[17]向 EMEM培養液中加入 10% 的新鮮胎牛血清（FBS）保存關節軟骨。在 4 ℃ 條件下保存 28 d 后，研究發現含有新鮮胎牛血清的保存液保存的軟骨細胞存活率可達 68%，而無血清的培養液保存的軟骨細胞活性只有 27%。但軟骨基質中黏多糖的含量并沒有明顯的差異。Onuma 等[18]向 UW 液中加入10% 同種異體血清，4 ℃ 條件下保存小鼠軟骨。實驗發現軟骨細胞存活率和細胞外基質成分均得到了提升，血清的加入一定程度上提高了保存效果，但是異體血清可能會引起免疫排斥反應以及增加疾病傳播的風險。

2.2 細胞生長因子

人體內存在各種各樣的細胞生長因子，能夠促進細胞的生長、修復，補充所需營養。Teng 等[19]利用含有胰島素樣生長因子（IGF-I）的 DMEM 培養液，4 ℃ 條件下保存牛關節軟骨，21 d 后進行細胞活性檢測發現細胞存活率高于不含胰島素樣生長因子培養液保存的軟骨，但 28 d 后細胞存活率迅速降低。Mickevicius 等[20]的研究也表明 IGF-I 在軟骨細胞的體外保存中可以在短時間內起到延長保存時間，提高保存效果的作用。同時，有研究發現轉化生長因子（TGF-β）能夠促進軟骨細胞生長和細胞外基質的生成[21]。

2.3 細胞凋亡抑制劑

細胞凋亡抑制劑在骨關節炎及軟骨體外保存的研究中得到了越來越多的應用[22]。在軟骨保存期間，細胞凋亡基因隨著保存時間的延長會明顯上調，導致軟骨細胞的凋亡，其中包括腫瘤壞死因子 α（TNF-α）[23]和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）。依那西普是治療類風濕關節炎和強直性脊柱炎的有效藥物，屬于 TNF-α 抑制劑。Linn等[24]在 4 ℃ 條件下保存布爾山羊軟骨 28 d，發現含有依那西普的保存液保存的表層軟骨細胞存活率可以達到69.3%，TNF-α 的表達低于不含依那西普的對照組。但深層軟骨細胞的存活率較低，黏多糖成分和組織學觀察沒有明顯差異。Caspase 是一種與細胞凋亡相關的蛋白酶，Teng 等[19]向 DMEM 培養液中加入 caspase 抑制劑 ZVAD-fmk，4 ℃下保存牛關節軟骨 21 d 發現，細胞凋亡抑制劑可以使軟骨細胞存活率升高，但是繼續保存 28 d 后細胞存活率嚴重降低。

2.4 激素

激素在機體的生長、代謝、發育中起重要的調節作用，在軟骨細胞的代謝過程中也具有調節作用。Bian 等[25]在37 ℃ 下，用含有地塞米松的 DMEM 培養液保存牛關節軟骨，發現含有地塞米松的 DMEM 培養液對于軟骨組織的保存有積極的效果，生物力學性能和細胞外基質成分優于不含地塞米松培養液保存的軟骨。表明地塞米松等激素可以成為延長保存效果的有效物質。

2.5 其他

表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）是從茶葉中提取的茶多酚，具有抗氧化、抗凋亡、抗炎特性的物質[26]。對于軟骨保存也有積極的意義。Bae 等[27]在 4 ℃ 條件下用含有 EGCG 的 RPMI1640PE 培養液保存髖關節軟骨和半月板，盡管細胞存活率在保存 14 d 和 28 d 后下降明顯，但是 EGCG 能夠延緩細胞存活率下降速度。氫氣是一種新型的選擇性抗氧化劑，同時具有抗凋亡、抗炎作用[28]，對多種疾病具有治療作用[29-31]，具有廣泛的應用前景。Yamada等[32]用含有氫氣的保存液來保存小鼠關節軟骨，發現氫氣可以提高軟骨保存效果。含有抗氧化、抗凋亡、抗炎特性物質的保存液成為今后保存液研究的熱點。

3 總結與展望

多個臨床跟蹤研究證明了同種異體軟骨移植手術在臨床上的成功應用[33-35]。美國同種異體軟骨移植手術數量近年迅速增多，由 2005 年的 660 例上升到 2011 年的 1619 例，同種異體軟骨移植成為治療關節軟骨疾病的重要方法[36]，而軟骨的體外保存效果成為軟骨移植手術成功與否的關鍵。目前我們可以從保存環境和保存液成分來改善軟骨的體外保存效果，使得同種異體軟骨移植手術得到廣泛應用。未來軟骨保存液的研究將會從細胞通路、生長因子、應力環境等方面入手，模擬人體關節內環境，解決軟骨保存過程中的問題，使同種異體軟骨移植手術的應用更加廣泛和有效。

[1] Sherman SL, Garrity J, Bauer K, et al. Fresh osteochondral allograft transplantation for the knee： current concepts. J Am Acad Orthop Surg, 2014, 22(2)：121-133.

[2] Krych AJ, Robertson CM, Williams RJ 3rd, et al. Return to athletic activity after osteochondral allograft transplantation in the knee. Am J Sports Med, 2012, 40(5)：1053-1059.

[3] Williams SK, Amiel D, Ball ST, et al. Prolonged storage effects on the articular cartilage of fresh human osteochondral allografts. J Bone Joint Surg Am, 2003, 85-A(11)：2111-2120.

[4] Williams RJ 3rd, Dreese JC, Chen CT. Chondrocyte survival and material properties of hypothermically stored cartilage： an evaluation of tissue used for osteochondral allograft transplantation. Am J Sports Med, 2004, 32(1)：132-139.

[5] Cook JL, Stannard JP, Stoker AM, et al. Importance of donor chondrocyte viability for osteochondral allografts. Am J Sports Med, 2016, 44(5)：1260-1268.

[6] Pallante AL, Chen AC, Ball ST, et al. The in vivo performance of osteochondral allografts in the goat is diminished with extended storage and decreased cartilage cellularity. Am J Sports Med, 2012, 40(8)：1814-1823.

[7] Pallante-Kichura AL, Chen AC, Temple-Wong MM, et al. In vivo efficacy of fresh versus frozen osteochondral allografts in the goat at 6 months is associated with PRG4 secretion. J Orthop Res, 2013, 31(6)：880-886.

[8] Song HQ, Qi JH, Xuan YH, et al. Application of tissue - cultured method on preservation of articular cartilage. Orthoped J China, 2007, 15(17)：1340-1343. (in Chinese)宋洪強, 亓建洪, 玄燕華, 等. 組織培養法在關節軟骨保存中的應用. 中國矯形外科雜志, 2007, 15(17)：1340-1343.

[9] Cook JL, Stoker AM, Stannard JP, et al. A novel system improves preservation of osteochondral allografts. Clin Orthop Relat Res, 2014, 472(11)：3404-3414.

[10] LaPrade RF, Botker J, Herzog M, et al. Refrigerated osteoarticular allografts to treat articular cartilage defects of the femoral condyles. A prospective outcomes study. J Bone Joint Surg Am, 2009, 91(4)：805-811.

[11] Qi JH, Hu ZJ, Song HQ, et al. Cartilage storage at 4 degrees C with regular culture medium replacement benefits chondrocyte viability of osteochondral grafts in vitro. Cell Tissue Bank, 2016, 17(3)：473-479.

[12] Garrity JT, Stoker AM, Sims HJ, et al. Improved osteochondral allograft preservation using serum-free media at body temperature. Am J Sports Med, 2012, 40(11)：2542-2548.

[13] Pallante AL, Bae WC, Chen AC, et al. Chondrocyte viability is higher after prolonged storage at 37 degrees C than at 4 degrees C for osteochondral grafts. Am J Sports Med, 2009, 37 Suppl 1：24S-32S.

[14] Diao HJ, Fung HS, Yeung P, et al. Dynamic cyclic compression modulates the chondrogenic phenotype in human chondrocytes from late stage osteoarthritis. Biochem Biophys Res Commun, 2017, 486(1)：14-21.

[15] Yang J, Huang W, Song GL, et al. Collagen and tissue inhibitor of metalloproteinase-3 expression in human osteochondral allografts in storage media. J Clin Rehabilitative Tissue Eng Res, 2011, 15(33)：6081-6084. (in Chinese)楊健, 黃偉, 宋國立, 等. 應力環境組織培養法保存的人骨軟骨移植物中膠原和基質金屬蛋白酶組織抑制劑 3. 中國組織工程研究與臨床康復, 2011, 15(33)：6081-6084.

[16] Wang X. The effects of different intensity hydrostatic pressure on the biological characteristics of chondrocytes of the knee joint. Xi’an： The Fourth Military Medical University, 2014. (in Chinese)王鑫. 不同強度靜水壓力對人膝關節軟骨細胞生物學特性的影響.西安： 第四軍醫大學, 2014.

[17] Pennock AT, Wagner F, Robertson CM, et al. Prolonged storage of osteochondral allografts： does the addition of fetal bovine serum improve chondrocyte viability? J Knee Surg, 2006, 19(4)：265-272.

[18] Onuma K, Urabe K, Naruse K, et al. Allogenic serum improves cold preservation of osteochondral allografts. Clin Orthop Relat Res, 2012, 470(10)：2905-2914.

[19] Teng MS, Yuen AS, Kim HT. Enhancing osteochondral allograft viability： effects of storage media composition. Clin Orthop Relat Res, 2008, 466(8)：1804-1809.

[20] Mickevicius T, Pockevicius A, Kucinskas A, et al. Impact of storage conditions on electromechanical, histological and histochemical properties of osteochondral allografts. BMC Musculoskelet Disord, 2015, 16：314.

[21] Poleni PE, Bianchi A, Etienne S, et al. Agonists of peroxisome proliferators-activated receptors (PPAR) alpha, beta/delta or gamma reduce transforming growth factor (TGF)-beta-induced proteoglycans' production in chondrocytes. Osteoarthritis Cartilage, 2007, 15(5)：493-505.

[22] Huang Y, Wan G., Tao J. C1q/TNF-related protein-3 exerts the chondroprotective effects in IL-1beta-treated SW1353 cells by regulating the FGFR1 signaling. Biomed Pharmacother, 2017, 85：41-46.

[23] Robertson CM, Allen RT, Pennock AT, et al. Upregulation of apoptotic and matrix-related gene expression during fresh osteochondral allograft storage. Clin Orthop Relat Res, 2006, 442：260-266.

[24] Linn MS, Chase DC, Healey RM, et al. Etanercept enhances preservation of osteochondral allograft viability. Am J Sports Med, 2011, 39(7)：1494-1499.

[25] Bian L, Stoker AM, Marberry KM, et al. Effects of dexamethasone on the functional properties of cartilage explants during long-term culture. Am J Sports Med, 2010, 38(1)：78-85.

[26] Rasheed Z, Rasheed N, Al-Shaya O. Epigallocatechin-3-O-gallate modulates global microRNA expression in interleukin-1β-stimulated human osteoarthritis chondrocytes： potential role of EGCG on negative co-regulation of microRNA-140-3p and ADAMTS5. Eur J Nutr, 2017. [Epub ahead of print]

[27] Bae JY, Han DW, Wakitani S, et al. Biological and biomechanical evaluations of osteochondral allografts preserved in cold storage solution containing epigallocatechin gallate. Cell Transplant, 2010, 19(6)：681-689.

[28] Ohsawa I, Ishikawa M, Takahashi K, et al. Hydrogen acts as a therapeutic antioxidant by selectively reducing cytotoxic oxygen radicals. Nat Med, 2007, 13(6)：688-694.

[29] Noda K, Shigemura N, Tanaka Y, et al. A novel method of preserving cardiac grafts using a hydrogen-rich water bath. J Heart Lung Transplant, 2013, 32(2)：241-250.

[30] Chen Y, Zong C, Guo Y, et al. Hydrogen-rich saline may be an effective and specific novel treatment for osteoradionecrosis of the jaw. Ther Clin Risk Manag, 2015, 11：1581-1585.

[31] Zhang X, Liu J, Jin K, et al. Subcutaneous injection of H2 is a novel effective treatment for type 2 diabetes. J Diabetes Investig, 2017. [Epub ahead of print]

[32] Yamada T, Uchida K, Onuma K, et al. Hydrogen supplementation of preservation solution improves viability of osteochondral grafts. ScientificWorldJournal, 2014, 2014：109876.

[33] Gobbi A, Scotti C, Lane JG, et al. Fresh osteochondral allografts in the knee： only a salvage procedure? Ann Transl Med, 2015, 3(12)：164.

[34] Bugbee WD, Pallante-Kichura AL, G?rtz S, et al. Osteochondral allograft transplantation in cartilage repair： Graft storage paradigm, translational models, and clinical applications. J Orthop Res, 2016, 34(1)：31-38.

[35] Levy YD, G?rtz S, Pulido PA, et al. Do fresh osteochondral allografts successfully treat femoral condyle lesions? Clin Orthop Relat Res, 2013, 471(1)：231-237.

[36] McCormick F, Harris JD, Abrams GD, et al. Trends in the surgical treatment of articular cartilage lesions in the United States： an analysis of a large private-payer database over a period of 8 years. Arthroscopy, 2014, 30(2)：222-226.

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.06.012

山東省自然科學基金（ZR2013HM034）

271000 山東泰安，泰山醫學院運動醫學研究所

亓建洪，Email：jhqi7281@163.com

2017-10-17