揭秘生物晝夜節律的分子機制
—— 2017諾貝爾生理或醫學獎解讀

王彥，滕花景，孫中生

揭秘生物晝夜節律的分子機制
—— 2017諾貝爾生理或醫學獎解讀

王彥，滕花景，孫中生

2017 年 10 月 2 日，諾貝爾獎評選委員會在瑞典首都斯德哥爾摩宣布，本屆諾貝爾生理學或醫學獎由美國的三位生物學家分享：布蘭迪斯大學遺傳學家杰弗里·霍爾（Jeffrey C. Hall）教授和同一大學的分子生物學家邁克爾·羅斯巴什（Michael M. Rosbash）教授，以及洛克菲勒大學的邁克爾·楊（Michael W. Young）教授，以表彰他們在揭示生物晝夜節律的分子機制方面做出的重大貢獻。

霍爾 1945 年出生于美國紐約，1971 年在西雅圖華盛頓大學獲哲學博士學位，1971 - 1973 年在加州理工學院西蒙·本哲（Seymour Benzer）教授實驗室從事博士后研究。1974 年就職于布蘭迪斯大學。2002 年后到美國緬因大學任職直至 2012 年退休。霍爾教授致力于果蠅求偶行為和生物節律的神經生物學研究。

羅斯巴什 1944 年出生于美國堪薩斯城。他師從謝耳頓·彭曼（Sheldon Penman）教授，于 1970 年獲得麻省理工大學生物物理學博士學位。而后在英國愛丁堡大學從事博士后研究。從 1974 年至今就職于布蘭迪斯大學。羅斯巴什早期的工作主要集中在 mRNA 的代謝和加工，而后主要從事生物節律的研究。

楊 1949 年出生于美國邁阿密。1975 年，在德克薩斯大學獲得遺傳學博士學位。1975 - 1977 年在斯坦福大學醫學院大衛·霍格內斯（Dave Hogness）實驗室從事博士后研究，主要研究領域為 DNA 重組。從 1978 年開始在洛克菲勒大學任職，致力于果蠅覺醒和睡眠周期的遺傳學研究。

1 晝夜節律分子機制的發現和證明是生命科學的一個重要進展

在自然界中，從單細胞的藍藻到高等動植物均存在著一種以 24 h 左右為周期的、按照一定規律運行的生命活動，稱之為晝夜節律。作為生命活動的基本特征之一，晝夜節律是由內源性“生物鐘”驅動的，是生物在長期進化過程中形成的與自然環境變化相適應的內源性節律[1-2]。該生物鐘既可以自激振蕩，又可以接受環境周期變化的信號來調控自激振蕩，使機體生命活動的晝夜節律與環境同步。生物鐘可以精準地調節機體的生理機能，包括激素水平、睡眠需求、體溫和新陳代謝等，保證機體的正常發育和生長。大量證據表明，當一個人的生活方式與內在生物鐘節律長期不相符時，患多種疾病的風險會增加，如肥胖、糖尿病、高血壓、高血脂和惡性腫瘤[3-8]。

對多種不同生命有機體的生物節律研究始于 20 世紀中期。如德國生物學家歐文·本林（Erwin Bunning）發現了植物葉閉合活動的節律行為[9-11]；德國醫生和生物學家尤金·阿紹夫（Jürgen Aschoff）在大鼠、小鼠、鳥類、恒河猴等多個物種和人類中觀察到了不同外環境刺激對生物節律行為的影響，并提出“倒班”制度對身心健康的可能危害[12-16]；美國生物學家科林·皮登覺（Colin Pittendrigh）研究了果蠅的生物節律行為[17]。本林、阿紹夫和皮登覺等的研究對生物節律存在的普遍性、基本特征和規律有了較為全面的描述和深入的了解，奠定了現代生物節律研究的基礎，因此他們三人被尊稱為“生物節律之父”。但他們當時的研究還無法從細胞和分子的水平闡明生物鐘的組成元件和運行機制。

1971 年，本哲首先發現影響果蠅生物鐘的基因突變，開啟了生物鐘的基因研究[18]。他們運用遺傳學方法建立了果蠅的突變株，并觀察這些果蠅的羽化節律。于 1971 年篩選到了三個突變果蠅品系，在節律周期上分別出現三個不同方向的改變（表型分別為“無節律”、“節律變長”和“節律變短”），并與同一個基因相關。他們將這一基因命名為“周期基因”（period，per），并在果蠅染色體中確定了per基因的位置，首次證明果蠅生物鐘行為是受基因調控的。

1984 年，楊和羅斯巴什這兩個研究團隊分別克隆了果蠅per的 DNA 序列[19-22]，其長度約為 4.5 kb[20,23]。將編碼per基因的 DNA 序列導入per突變果蠅，即可恢復其晝夜節律[20]。他們還進一步發現，per基因的 mRNA的表達水平呈現與晝夜同步的節律變化[24]，早晨水平較低，夜晚水平升高。per編碼的蛋白 PER 位于細胞核中[25]，其水平也呈現類似的晝夜節律變化[26-27]。PER 蛋白受磷酸化調節，同時也受per表達水平的調節[28-29]。在生物鐘變短的果蠅突變株per中，per的 mRNA 和 PER 蛋白水平的晝夜節律周期均顯著變短[24,29]，提示per的基因轉錄的 mRNA 與翻譯的 PER 蛋白存在負反饋調節。此研究為揭示“轉錄-翻譯負反饋環路（transcription-translation feedback loop）”理論奠定了基礎[24]。此外，羅斯巴什和楊團隊還發現permRNA 與蛋白的晝夜節律之間有一定的間隔，也就是“相位”不同，PER 蛋白和permRNA 這種節律變化在“持續黑暗條件（constant darkness）”下依然存在[29]。

繼per基因之后，其他生物鐘基因也相繼被克隆。1994年，楊實驗室鑒定并克隆了果蠅的timeless基因（tim），還發現tim可以影響 PER 蛋白出入細胞核[30-32]。1998 年，羅斯巴什實驗室在果蠅中發現了clock基因[33]；霍爾實驗室發現了 chryptochrome（cry）基因參與果蠅生物鐘[34]；霍爾和羅斯巴什團隊合作發現了 cycle 基因（cyc）[35]等。

現在我們對以 24 h 為周期的果蠅生物鐘的分子構成和運行機制已有了基本了解：在細胞核內，CLK 和 CYC蛋白（正向調節因子）形成異二聚體，通過結合per、tim和cry（負向調節因子）啟動子區域的 E-box 元件，激活這些基因的轉錄；在細胞質內，PER、TIM 和 CRY 蛋白形成異二聚體后轉移到核內，通過與正向調節因子結合而抑制負向調節因子本身的轉錄，進而形成轉錄-翻譯負反饋環路[36]。

晝夜節律基因及其運行調控機制也同樣存在于哺乳動物中。1994 年，美國西北大學的約瑟夫·高橋（Joseph Takahashi）發現了小鼠的生物鐘clock基因（clk）[37]，并在 1997 年克隆了clk的 DNA 序列[38-39]。同年，美國貝勒醫學院和日本東京大學的兩個實驗室在小鼠和人類基因組中分別發現和克隆了per基因[40-41]。

此外，美國約翰·霍普金斯大學的科特·瑞科特（Curt P. Richter）教授也對大鼠的生物鐘行為做了多方面的深入研究，他們提出下丘腦的前端可能是哺乳動物生物鐘的振蕩器所在位置[42-43]。美國的伯克利加州大學的朱可（Irving Zucker）[44]和芝加哥大學的莫爾（Robert Moore）[45]發現了下丘腦前端的視交叉上核是啟動大鼠生物鐘的關鍵元件。日本東京大學的井上進一（Shin-Ichi Inouye）和川村宏（Hiroshi Kawamura）發現視交叉上核（suprachiasmatic nucleus，SCN）神經細胞可能起調控和協調周圍組織的生物鐘保持同步運行的作用，從而被稱為“主鐘”（master clock）[46]。

2 我國科學家在該領域的貢獻

我國科學家也為揭示生物鐘運行的分子機制做出了重要貢獻。他們中很多人在國外留學或工作期間參與了這一領域的重要工作。多名中國留學生參與了羅斯巴什實驗室對果蠅生物鐘的研究，如：俞強發現了果蠅 PER 蛋白缺失某一特定區段會影響其求偶時翅膀有節律地歌唱[47-48]；黃佐石發現 PER 可通過其 PAS 功能域與含有 bHLH-PAS 功能域的轉錄因子形成異二聚體，進而調節生物節律基因的轉錄[49]；劉欣發現了per基因的時空表達和 PER 蛋白的亞細胞定位[25,50]；曾紅葵闡明了 PER-TIM 復合體在果蠅生物鐘的調控作用[51]。

在哺乳類動物生物節律的研究中也有我國科學家的貢獻。1997 年，在美國貝勒醫學院從事博士后研究的孫中生等在克隆小鼠乳腺癌基因的過程中，發現一個基因與果蠅的生物鐘基因per呈現高度的局部序列相似性，通過動物實驗發現該基因的表達具有 24 小時的節律，且能隨光周期的改變而變化。他們依據我國古老的授時裝置——“日晷”，特地將該基因命名為 RIGUI[41]，隨后該基因被正式命名為per1。此外，他們還在小鼠和人中發現了per基因的第二個同源基因per2。Per2 基因在晝夜節律的控制中樞——視交叉上核中的表達相對于per1 推遲 4 ～ 6 h，但與per1 一樣具有晝夜節律基因的所有特性。為了確定per1、per2 基因在調節晝夜節律中的作用，他們通過基因敲除成功獲得了per1-/-、per2-/-、per1/2 雙敲除三種小鼠品系。在持續黑暗條件下，per1/2 雙敲除小鼠完全丟失活動節律性。但在同樣條件下，一些per2-/-小鼠的節律周期變短或丟失，而per1-/-小鼠節律周期則變長[52-53]。在成功克隆小鼠的生物鐘基因以后，他們首次測定了人類外周血單核細胞（PBMCs）中per1、per2、per3 和DEC1 節律基因的表達模式，揭示了哺乳動物免疫生物鐘的存在[54]，發現生物鐘基因per2 參與調控免疫功能和內源的免疫應答[55]。此外，他們的研究還證明了機體內生物鐘系統是疼痛節律性產生的物質基礎，為臨床痛癥的時間生物學治療奠定了理論基礎[56]。但是轉錄組水平的研究發現僅有不到 20% 的基因的節律表達受轉錄-翻譯負反饋環路調控。最近，他們與中南大學李家大教授的團隊合作，通過整合近 5000 個哺乳動物晝夜節律相關的轉錄組和調控組數據，對 37 個人或小鼠的組織/細胞系、三種臨床疾病的基因表達模式和調控因素進行了系統分析，開發了一個方便用戶挖掘節律相關信息的平臺—— CirGRD（http：// cirgrdb.biols.ac.cn/），為進一步揭示生物鐘基因調節各種生理過程及疾病發生的分子機制奠定了基礎[57]。

2001 年，當時在美國舊金山加州大學工作的傅穎慧等通過對一家族性睡眠相位提前綜合征患者的家系進行遺傳分析，發現家系中的一個含有hper2 編碼的特定位點變異（對應于其蛋白質序列的 662 位絲氨酸）的成員，相位比一般人提前 4 小時，每天早上 4 點半醒，晚上 7 點半睡；凡是這個位點沒有變異的成員，睡眠相位就正常[58]。2005年，當時在傅穎慧實驗室工作，現執教于蘇州大學的徐瓔教授發現 CKIδ 基因突變也能導致人和小鼠相位提前[59]。現在北京生命科學研究所，當時在美國加州大學圣地亞哥分校從事博士后研究的張二荃首次運用 RNAi 技術篩選生物鐘基因，找到了多個影響人類生物鐘的基因[60]。中山大學的郭金虎教授于 2009 年在美國德克薩斯大學西南醫學中心的劉一教授實驗室從事博士后研究期間，發現了一條新的轉錄后負反饋回路能通過影響 mRNA 的穩定性來調節脈孢菌的晝夜節律[61]。

3 結語

隨著生物鐘基因的克隆及生物鐘核心分子調控機制的發現，生物節律的研究重點已經轉移到生物鐘基因是如何在分子水平上調節各種生理過程及疾病的發生。生物鐘調控環路不僅僅只影響其內部各節律基因的表達呈節律性變化，而且通過正向調控和負相調控機制的作用，進一步影響下游基因也呈現這種節律性的表達變化。轉錄組水平的證據表明，在各種不同的組織中，有 10% ～ 15% 的基因在 RNA 水平的表達具有節律性。這些下游基因在更多生理過程中承擔著重要的調節作用，所以也使得哺乳動物體內的多種生理行為的變化呈現節律[62-66]。這些節律基因的表達是受多層次不同水平調控的，除了受經典的轉錄-翻譯負反饋環路調控外，轉錄后調控如組蛋白修飾、染色質高級結構等在其節律表達中亦發揮了重要的作用。因此，在細胞-組織-器官-生物體的整體水平上解析生物鐘的元件并揭示其調控機制，不僅對我們了解生命和生命活動具有重大的理論意義，而且將為治療由于晝夜節律失常所引發的人類疾病提供有價值的線索[67-69]。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2017.06.009

國家自然科學基金（31200888）

100101 北京，中國科學院北京生命科學研究院

孫中生，Email：sunzs@biols.ac.cn

2017-10-23