Y染色體微缺失對ICSI結局的影響研究進展

劉 琳趙小東溫 臻任麗臻王藝嶸成玥美綜述 張學紅審校

1.蘭州大學第一醫院生殖醫學專科醫院（蘭州 730000）；2.甘肅省生殖醫學與胚胎重點實驗室；3.蘭州大學

Y染色體微缺失對ICSI結局的影響研究進展

劉 琳1,2趙小東1,2溫 臻3任麗臻3王藝嶸3成玥美3綜述 張學紅1,2審校

1.蘭州大學第一醫院生殖醫學專科醫院（蘭州 730000）；2.甘肅省生殖醫學與胚胎重點實驗室；3.蘭州大學

全世界不育夫婦約占已婚育齡夫婦的10%～15%，其中因男性因素導致的約占50%，少精子、弱精子癥是造成男性不育或生育力下降的主要原因之一。細胞遺傳學和分子生物學等領域的快速發展使得無精子因子（azoospermia factor, AZF）[1]被科學家們廣泛認知并接受。AZF位于 Y染色體長臂（Yq），這一區域的異常與大多數原發性無精子癥密切相關[2]，其發生率在男性不育的遺傳因素中居第二位，僅次于Klinefelter's syndrome [克氏綜合征，(47, XXY)]。約有10%～20%男性原發無精子與少精子癥患者中存在AZF微缺失。

卵胞漿內單精子顯微注射技術（Intracytoplasmic sperm injection, ICSI）的出現，改寫了以前人們普遍認為的無精子癥患者和嚴重少精子癥患者無法生育的觀念，但此項新技術的出現，也不可避免的將攜帶染色體異常、基因缺失或突變的精子注入到卵胞漿內，使得各種遺傳缺陷傳遞給下一代的風險大大增加。由于 ICSI 操作逃避了一些自然選擇屏障，Y染色體微缺失或染色體異常患者的后代將面臨遺傳缺陷垂直傳遞的風險。因此，深入研究Y染色體微缺失在ICSI過程中的重要作用對輔助生殖技術的發展具有重要意義。本文對現有的關于Y染色體微缺失對ICSI成功率影響的各種研究作一綜述。

一、AZF的構成

1996年Vogt等[1]將AZF基因劃分為 3個無重疊部分，分別命名Yq11的近段、中段和遠段為AZFa、AZFb和AZFc。有大量的回文序列存在于Y 染色體上，其內部的非等位基因同源重組是Y染色體微缺失的主要原因。1999年，Kent- First 等研究者發現在AZFb和AZFc之間存在一個AZFd區[3]，缺失率大約為5%，占AZF總缺失的19.6%。一般認為，該區的缺失存在于中等程度的少精子或數目正常但形態異常精子的患者中，但該區域內的候選成分至今尚未找到，該區是否存在仍有爭議。

二、Y染色體微缺失的發生類型

目前已經發現的Y染色體微缺失類型主要包括：AZFa區缺失、AZFa區部分缺失，AZFb區缺失、AZFb區部分缺失，AZFc區缺失、AZFc區部分缺失以及其他區域的聯合缺失如AZFb+c區缺失和AZFa+b+c區缺失等[4]。AZFb區及AZFc區由擴增子家族blue (b)、turquoise (t)、green (g)、red (r)、yellow (y)、gray(g)組成，多為順向重復和反向重復序列，減數分裂過程中擴增子發生同源重組是AZFb區、AZFc區及AZFb+c區域聯合缺失發生的分子基礎[5]。

現有的研究表明，Y染色體微缺失發生的原因主要有以下3種：（1）de novo 缺失：是指患者缺失而患者男性直系親屬外周血分析中未見缺失。這種缺失類型可能發生在父代精子生成的過程中或在子代早期胚胎發育過程中產生[1,6,7]；（2）垂直遺傳：是指父代睪丸生殖細胞系存在缺失并產生有缺失的精子，缺失精子與卵子結合產生繼承了其父親生殖細胞中有缺失的Y染色體微缺失的子代個體[8,9]；（3）在睪丸生殖細胞系中存在缺失的嵌合體，如父親外周血淋巴細胞中未見缺失，而通過ICSI的男性后代卻有Y染色體微缺失，則說明嵌合體的存在[10]。

三、Y染色體微缺失的檢測

對無精子癥或者嚴重少精子癥患者來說，Y染色體微缺失是常規檢測項目。 2004年歐洲男科學會（EAA）和歐洲分子遺傳實驗質控網（EMQN）提出了Y染色體微缺失檢測標準，即采用聚合酶鏈反應進行檢測分析，90%以上的微缺失可以被檢出。最新版指南推薦采用兩管多重PCR方法，檢測位點如下：AZFa： sY84，sY86；AZFb：sY127，sY134；AZFc：sY254，sY255對照：SRY，ZFX，ZFY[11]。

一般人群中Y染色體微缺失發生的概率約為1/4 000，在無精子或少精子的不育男性中比例則顯著增加。依據不同實驗室及不同研究人群，Y染色體發生的概率大約為1%～58%。一般而言，在非梗阻性無精子癥患者中缺失的概率大約為15%～20%，在少精子癥患者中微缺失發生的概率大約為7%～10%，需要做ICSI的患者中缺失比例大約占到2%～3%[12,13]。

國內外研究顯示，不同種族、地區的嚴重少精子癥或無精子癥的不育男性，其Y染色體微缺失的發生概率不同，為0.7%～34.5%間不等，具有明顯的地區與種族差異[14]。

四、Y染色體不同類型缺失的重要臨床意義

為了尋找不育的原因、獲得自身和后代遺傳學咨詢、選擇助孕方式，無精子癥和嚴重少精子癥的不育患者需要在接受助孕治療前進行Y染色體微缺失的檢測。Y 染色體微缺失發生的區域不同，相應的臨床表型也有所不同，檢測出的微缺失類型對睪丸活檢能否發現成熟精子預測的意義不同。由于Y 染色體在精子發生時, 無法同其他常染色體一樣，進行DNA修復，因此只要有一個基因出現微缺陷就會發生效應。

1. AZFa區完全缺失大多表現為唯支持細胞綜合征，大約占到5%。完全缺失的患者，其精子阻滯在青春期前階段，無生育能力并伴有睪丸體積縮小，為絕對的無精子癥，無法通過ICSI獲得后代[15-19]。

2. AZFb區缺失和AZFb+c區缺失大約占總缺失的35%左右，完全缺失的患者表現為生精阻滯，主要停留在精母細胞或精子細胞階段；部分缺失的患者臨床表現多樣化，包括唯支持細胞綜合征、無精子癥或少精子癥，不推薦給這類病人施行ICSI[20,21]。

以上3種類型的微缺失提示非阻塞性無精子癥，睪丸取精術（testicular sperm extraction, TESE）/經皮附睪抽吸取精術（percutaneous epididymal sperm aspiration, PESA）常取精失敗，故應避免患者進行穿刺取精的痛苦。

3. AZFc區缺失大約占到35%，該區域的缺失會造成超過60%AZF區域發生缺失。該類患者的臨床和睪丸組織學表型具有多樣性：可以表現為性激素水平和睪丸體積的正常或異常；可以有正常的生育能力，從而導致AZFc缺失的垂直遺傳；也可以為無精子癥和少弱精子癥，導致不育[22]。趙連明等的研究表明，雖然大約有50% 的單獨 AZFc 缺失患者能射出精子，但大部分人表現為重度或者嚴重少精子癥，長期藥物治療效果不明顯，應及早對這類患者經皮附睪精子抽吸術/睪丸附睪取精（TESE/PESA）技術獲得精子，而后采用ICSI可成功受孕[23]。

4. AZFd 區缺失主要表現為精子數目正常，但精子形態異常或者是輕度的少精子癥。

5. AZFa+b+c 3個區域全部缺失的患者，一般表現為染色體核型異常。臨床100%表現為無精子癥，無法從睪丸中獲得精子。因此，可以不必對這類患者進行睪丸穿刺增加其痛苦，同時女方應避免進行促排卵治療，使患者無謂增加經濟負擔，并造成女方因促排卵可能面臨的并發癥[24]。

值得注意的是，AZFc區缺失患者可能出現隨時間進行性精子數量減少的現象，最終可發展至無精子癥[25-27]。為避免發展到有創傷的取精或者不能生育，這些患者應及早治療或提前進行精液冷凍保存，并通過胚胎植入前遺傳學診斷（preimplantation genetic diagnosis, PGD）的方法選擇女性胚胎, 從而避免Y染色體微缺失的傳遞。另外，AZFc區缺失患者的男性子代將是AZFc區缺失的攜帶者。因此，AZFc區域缺失患者的男性后代在成年早期也應考慮精液冷凍保存。

另外，部分患者有內分泌異常的表現，臨床上可表現為原發睪丸衰竭，導致激素水平的改變，睪酮產生減少、FSH增高、LH正常或相應不同程度的增高表現[28]。

五、Y染色體微缺失對ICSI結局的影響

Y染色體微缺失的個體因其精子發生過程存在缺陷，所以這種缺失在自然受孕的情況下很少代代相傳。ICSI技術的出現使無精子和少精子癥患者獲得生育機會，但也可能會向卵胞漿內注入未經自然選擇的攜帶染色體異常或Y 染色體微缺失的精子，從而將這些遺傳缺陷垂直傳遞給下一代，影響人類的優生和自然進化。

1. Y染色體微缺失自然傳遞給男性后代 Y染色體微缺失的主要表型是男性不育，因此，通過自然傳播的AZF缺失的報道比較少見。Kühnert等報道了一例特殊病例：AZFc區缺失由父親垂直遺傳給兒子[29]。Zhu等發現在19例漢族不育男性中，AZFc區的缺失可以垂直遺傳兩代到三代[30]。Samli等發現一例父親將AZFb區缺失垂直自然遺傳給3個兒子的特殊病例[31]。Dai等的研究表明，父親具有Y染色體微缺失，則其傳遞給兒子的概率約為70%[6]。這也說明，盡管AZFc缺失嚴重影響精子發生的過程，但并不能完全阻滯自發懷孕。

2. Y染色體微缺失通過ICSI 傳遞給男性后代 男性不育患者因ICSI技術的大力發展，使得助孕技術翻開了新的篇章，然而越過自然選擇機制的行為使得子代遺傳缺陷風險顯著增加。與自然傳遞給子代相比，Y染色體的微缺失因ICSI傳遞給子代則有相對較多的報道。

1996年，Kent-First等[32]首次得到32對因男方因素不育的夫婦通過ICSI 獲得子代的研究。對父親具有Y染色體微缺失的3對父子進行研究，其中2對父子具有AZFb和AZFc之間區域的缺失，第三對父子具有AZFb和AZFc區域大片段的缺失。通過ICSI產生的子代Y染色體微缺失的概率為9.4%，這個概率和普通男性不育中微缺失的概率相近。Liu等[33]研究了199個漢族父親和來自輔助生殖技術的228個子代之間的Y染色體微缺失的情況，其中行IVF出生的子代85個、ICSI出生的子代73個，自然懷孕70個。研究結果表明，Y染色體微缺失的概率在IVF，ICSI，以及自然懷孕案例中的比例分別為10.7%，3.2%和8.2%，無顯著性差異。在70例自然生產的子代中新發1例子代Y染色體微缺失，在158例經輔助生殖產生的子代中未發生Y染色體微缺失。研究結果表明，輔助生殖技術并不能顯著提高子代Y染色體微缺失的概率。Oates等[34]的研究表明，42例AZFc區缺失的父親通過ICSI生育得到的子代中18例均遺傳了其父代的AZFc區缺失，但其缺失長度并未增加。國內學者王麗霞等[35]在488名無精子、少精子癥患者中發現56例患者存在Y染色體微缺失，且均為AZFc缺失。比較少精、無精患者缺失組和未缺失組未發現有胎兒畸形、流產率、早產率、后代出生體質量、雙胎妊娠率與男嬰比例等存在差異。缺失組成功妊娠19例，其中出生男嬰8例，行AZF微缺失檢測，發現均為AZFc缺失。由此可知，AZFc微缺失可以由父親遺傳給男性子代，缺失片段的長度和類型基本一致，但是成年后同樣會有精子發生障礙和不育的風險，這與近年來的文獻報道的結果相一致[36-40]。而國內外文獻對從父親垂直遺傳而來的除AZFc區之外的缺失類型尚未見報道，同時亦沒有證據證明AZF微缺失患者的后代的缺失范圍會擴大。

van Golde等[42]比較19例AZFc區缺失患者和同期239例正常精液排出的ICSI妊娠結局，結果發現，AZFc區缺失患者的受精率，胚胎質量遠遠低于對照組，但是妊娠率和帶嬰回家率之間并無顯著差異。國內孫寶剛等[41]對109例妻子不明原因流產男性患者進行檢測，結果表明：在109例反復流產夫婦中Y染色體異常28例。Y染色體結構異常18例，數目異常2例，多態性變異8例，未發現存在Y染色體缺失的病例。吳畏研究組[43]比較了Y 染色體微缺失患者和無缺失的無精子或嚴重少弱精子癥患者的ICSI治療結局。結果表明，兩組在女方年齡、不孕年限、男方年齡、獲卵數、ICSI 卵子數、平均移植胚胎數等基本情況差別無統計學意義；Y染色體微缺失組與對照組相比，受精率、卵裂率、優質胚胎率、胚胎種植率、生化妊娠率、臨床妊娠率、早期流產率、活產率差別無統計學意義，說明Y染色體微缺失不影響ICSI治療結局。王麗娟研究組[44]以22例Y染色體微缺失患者進行的27個ICSI治療周期為研究組，以88例無缺失的嚴重少精子癥或無精子癥患者101個ICSI治療周期為對照組。研究結果表明，研究組和對照組的受精率、卵裂率、優質胚胎率、新鮮周期移植優質胚胎率、臨床妊娠率、胚胎著床率、早期流產率、活產率、男嬰比例等均無統計學差異。以上研究結果都表明，Y染色體微缺失對ICSI治療周期的妊娠結局無顯著性影響。

3. Y染色體微缺失不同缺失熱點對ICSI成功率的影響 研究表明：Y染色體微缺失患者缺失的熱點不同，影響ICSI的成功率不同，這一點與缺失熱區分布和睪丸組織學類型的關系相一致。吳畏研究組[43]的結果表明，雖然ICSI治療周期形成的胚胎情況和妊娠結局與Y染色體微缺失并無顯著性影響，但不同的缺失位點導致的ICSI結局是不盡相同的，其他類型Y染色體微缺失患者配偶臨床妊娠機會低于AZFd區部分缺失加c區全部缺失患者。Zhu等[45]2015的最新研究共招募61例AZFc區缺失的不育患者，根據sY152是否單獨缺失為標準將實驗組分為兩組，以50例無精子或少精子但無缺失的患者為對照組。研究結果發現，sY152組和AZFc組的受精率較對照組低。3組之間在MII卵數、胚胎質量、2PN數、可移植胚胎數、臨床妊娠率、種植率、流產率、多胎率、分娩率、男/女性別比率等方面沒有顯著差異。提示sY152單獨缺失導致較低的受精率，但對最終的妊娠結局不產生大的影響。de Llanos等[46]比較了4例gr/gr缺失患者的ICSI結果，研究表明，取卵數、合子數及妊娠率均無顯著性差別，與Oates等[34]的研究結果一致。

六、結語

男性不育患者多數因病因不清缺乏特異有效的治療。因采用不恰當的治療方法造成的資源、人力的浪費和病人的痛苦令人擔憂。結合國內外關于Y染色體微缺失的研究進展，我們建議將Y染色體微缺失的篩查作為對男性不育患者的一項常規檢查項目，找到不育的真正原因，從而避免不必要的藥物及手術治療。

盡管已經有大量的針對Y染色體微缺失的研究，然而來自不同地理分布，不同民族的人群得到的結果并不是很一致，甚至出現相反的結果。基于現在已經得到的數據，我們可以得到以下基本信息：（1）Y染色體微缺失在無精子癥以及嚴重的少精子癥患者中十分常見；（2）盡管大多數的AZF缺失是新發的，仍有通過自然孕育或ICSI垂直遺傳給子代的缺失；（3）為了更好地了解Y染色體微缺失發生的機制，對病人的篩選標準要更加準確，臨床資料的登記以及各種檢查指標應標準化，應加強對男性不育患者Y染色體微缺失的父代和子代的追蹤和隨訪，以期正確評估Y染色體微缺失通過ICSI技術對子代可能造成的風險，并通過遺傳家系研究進一步明確。

ICSI技術的普遍開展和大規模應用引起的下一代男性不育問題會慢慢凸顯，輔助生殖科研人員應盡早從分子流行病的角度深入研究Y染色體微缺失的遺傳機制，使Y染色體微缺失的檢測不僅僅是一種檢測手段，同時成為一種合理有效的預測及阻斷手段。

致謝：本文由甘肅省衛生行業科研計劃項目（項目編號：GSWSKY-2015-50）；蘭州大學第一醫院院內基金（項目編號：ldyyyn2013-04）；蘭州大學國家級大學生創新創業項目（項目編號：201710730170）基金資助

Y染色體/遺傳學; 精子注射, 細胞質內;生殖技術, 輔助; 不育, 男性

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（2017-04-05收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2017.03.015

R 698.2