芪藍膠囊對前列腺癌血管生成擬態(tài)形成的影響研究*

俞旭君尤耀東李俊君常德貴陽 方董 良吳天浪**

1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)（四川成都 610075）；2. 成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院

芪藍膠囊對前列腺癌血管生成擬態(tài)形成的影響研究*

俞旭君1尤耀東2李俊君1常德貴1陽 方1董 良1吳天浪2**

1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)（四川成都 610075）；2. 成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院

目的觀察芪藍膠囊對前列腺癌血管生成擬態(tài)（Vasculogenic mimicry，VM）形成的影響，探討芪藍膠囊干預(yù)VM形成的作用規(guī)律及“量-效”關(guān)系。方法采用細(xì)胞的3D培養(yǎng)技術(shù)建立前列腺癌細(xì)胞（PC-3）體外培養(yǎng)體系，將3D培養(yǎng)的細(xì)胞隨機分為：空白對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組4組。采用不同劑量的芪藍膠囊含藥血清分別干預(yù)上述組別，48h后在電鏡下進行觀察。結(jié)果空白組中可見VM形成的各類表現(xiàn)，管狀形態(tài)良好。芪藍膠囊低劑量組的VM數(shù)量較空白組略少，管腔通道形成尚可。中、高劑量組別僅見極少量直行通道形成。結(jié)論芪藍膠囊能夠有效控制前列腺癌VM的形成，并且隨著劑量的增加，VM被抑制得更加明顯。

芪藍膠囊; 前列腺腫瘤; 血管生成擬態(tài); 劑量效應(yīng)關(guān)系, 藥物

血管生成擬態(tài)（Vasculogenic mimicry, VM）是前列腺癌血管生成的重要環(huán)節(jié)，是腫瘤組織維持持續(xù)性血液供應(yīng)的一種新型血供模式[1]。芪藍膠囊是成都中醫(yī)藥大學(xué)男科團隊經(jīng)過8年多的臨床總結(jié)和篩選，由黃芪、絞股藍、蜣螂、土茯苓和葫蘆巴5味藥物組成。前期研究表明能夠改善前列腺癌患者排尿癥狀和提高生活質(zhì)量。本研究主要觀察不同劑量芪藍膠囊含藥血清對體外3D培養(yǎng)的前列腺癌細(xì)胞VM生成情況的作用，以揭示其作用機制。

材料與方法

一、材料

（一）細(xì)胞

人前列腺癌PC3細(xì)胞（中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫）

（二）動物

SPF級SD雄性大鼠20只，320～350g，成都達碩生物科技有限公司，SCXK（川）2013-24。動物接收后進行適應(yīng)性觀察3～7d，合格后開始試驗，用于含藥血清制備。

（三）主要試劑和設(shè)備

BeaverNanoTM3D細(xì)胞培養(yǎng)水凝膠（蘇州，海貍）；DMEM/F-12培養(yǎng)基（美國，Corning）； 12孔培養(yǎng)板（美國，Corning）；一次性微孔濾器（美國，Merck Millipore）。

低溫冷凍離心機（德國，Heraeus）；相差倒置顯微鏡（日本，OLYMPUS）；微量加樣槍及Tip頭（德國，Eppendorf）；超凈工作臺（江蘇蘇凈）。

二、方法

（一）芪藍膠囊藥液制備

1. 芪藍膠囊組成：黃芪20g，絞股藍20g，葫蘆巴15g，蜣螂5g，土茯苓10g。

2. 制備方法與質(zhì)量控制：制備方法：芪藍膠囊以湯劑（合劑）形式在臨床上應(yīng)用，對水提取工藝確定了最佳工藝條件為：將黃芪、絞股藍、葫蘆巴、蜣螂、土茯苓置煎器內(nèi)，加水1000mL，煎30min，濾取藥液。藥渣加水600mL，再煎20min，濾取藥液。將兩次煎出液合并，即得。為給藥方便將藥液濃縮為100mL，即生藥量0.7g /mL。

質(zhì)量控制：參照2010年版《中國藥典》對各藥材的相關(guān)規(guī)定進行質(zhì)量檢查，出具質(zhì)量檢查報告書。

（二）芪藍膠囊含藥血清制備[2]

20只SD大鼠隨機分為2組：空白對照組、實驗組，每組10只。芪藍膠囊按臨床等效劑量的10倍灌胃給藥，空白對照組給予生理鹽水，按10ml/kg體質(zhì)量灌胃。每天上午、下午各1次，連續(xù)3d，末次給藥1h后，腹主動脈取血，離心分離血清，56℃水浴30min滅活，分裝，-80℃凍存?zhèn)溆谩Ｖ苽浜幯搴螅捎么?lián)質(zhì)譜檢測含藥血清中主要指標(biāo)成分，包括黃芪甲甙、胡蘆巴堿等。

（三）實驗用細(xì)胞準(zhǔn)備及操作方法

1. 細(xì)胞復(fù)蘇：液氮罐中拿出PC-3細(xì)胞凍存管，迅速放入37℃水浴，連續(xù)搖晃使之在2min內(nèi)融化后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管，加入DMEM/F-12 2mL，吹打混勻。離心5min后，吹打使混勻成單細(xì)胞懸液。將制備的懸液移至容量25mL的培養(yǎng)瓶中，加入DMEM/ F-12（含10%FBS）5mL。

2. 細(xì)胞傳代培養(yǎng)：細(xì)胞株置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。常規(guī)添加雙抗，每3天進行換液。當(dāng)瓶底細(xì)胞分布達80%時進行傳代。加入1mL濃度為0.25%的胰酶，37℃恒溫箱內(nèi)3～6min進行消化，倒置顯微鏡觀察，出現(xiàn)貼壁細(xì)胞胞質(zhì)回縮，細(xì)胞形態(tài)從原來的梭形成為橢圓形，并有少量細(xì)胞出現(xiàn)脫落。終止消化：加入5mL原培養(yǎng)液以中和胰酶，用2mL吸管輕輕多次吹打，至細(xì)胞完全脫落，形成細(xì)胞懸液。將懸液移至離心管中，離心5min。棄去上清液，加入1mL DMEM/F-12使細(xì)胞再次懸浮，然后裝入3個新的培養(yǎng)瓶。每個培養(yǎng)瓶加含10%FBS的DMEM/F-12培養(yǎng)基5mL，置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，直至獲得足夠數(shù)量的細(xì)胞用于實驗。

3. 細(xì)胞計數(shù)：清洗計數(shù)板及蓋玻片，吹干備用。吸管輕輕吹打使細(xì)胞混勻，馬上吸取數(shù)滴懸液，移至1.5mL EP管。蓋上玻片，再次吹打、混勻懸液，隨即用移液槍吸取10μL，輕輕加入到計數(shù)板邊緣，使之剛好充滿計數(shù)板和玻片間空隙。計算細(xì)胞數(shù)，壓方格線時只計左、上線，右、下線不計在內(nèi)。如密度過高，可先稀釋再計算。計算公式：（方格細(xì)胞數(shù)/4）×104×稀釋倍數(shù)。共計數(shù)3次，取平均值。

4. 三維細(xì)胞培養(yǎng)（BeaverNano? 3D細(xì)胞培養(yǎng)方法）：使用渦旋震蕩儀將水溶膠室溫下處理30min，降低黏度，同時避免產(chǎn)生氣泡。然后將水凝膠原溶液、無菌蔗糖原溶液和去離子水按比例配制成2×水凝膠工作液。離心收集經(jīng)胰蛋白酶消化過的細(xì)胞，將細(xì)胞懸浮在5mL無菌蔗糖工作液中，重復(fù)一次，配制成2×細(xì)胞工作液。然后將等體積（2×）細(xì)胞工作液加到（2×）水凝膠工作液中，然后輕輕將兩者混合均勻制成水凝膠-細(xì)胞混合液。將水凝膠-細(xì)胞混合液加入到細(xì)胞培養(yǎng)板孔中，將細(xì)胞培養(yǎng)液沿著細(xì)胞培養(yǎng)板孔邊緣輕輕注入到水凝膠-細(xì)胞混合液上部。最后，將載有3D細(xì)胞培養(yǎng)皿的細(xì)胞培養(yǎng)板置于二氧化碳培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，過程中更換二次培養(yǎng)液，經(jīng)過12h的3D培養(yǎng)后，更換一次新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液，同時加入含藥血清。

（四）分組與結(jié)果判定

1. 分組：將3D培養(yǎng)的細(xì)胞隨機分為4組，即空白對照組、芪藍膠囊低、中、高劑量組，每組設(shè)3個復(fù)孔。

2. 含藥血清劑量：芪藍膠囊含藥血清按10%，5%，2.5%（培養(yǎng)體系體積比）設(shè)置高、中、低劑量組給藥，不足10%的組別用胎牛血清補足；空白組采用10%大鼠空白血清給藥，作用時間48h。

3. 形態(tài)學(xué)監(jiān)測及VM判定：采用顯微鏡對培養(yǎng)孔中的細(xì)胞進行觀察。良好的VM鏡下表現(xiàn)形式可以為直的、平行排列的、十字交叉的、彩虹樣的（沒有完全封閉）、有分支的彩虹樣的、封閉的環(huán)狀和網(wǎng)絡(luò)狀的通道。結(jié)構(gòu)越呈現(xiàn)出立體的管狀或分支狀態(tài)，說明VM的形態(tài)越好。

結(jié) 果

一、模型的建立

所有組別均成功建立前列腺癌PC-3細(xì)胞3D培養(yǎng)模型。

二、空白組VM形成的表現(xiàn)

空白組中可見VM形成的各類表現(xiàn)，如直的、平行排列的、十字交叉的、彩虹樣的（沒有完全封閉）、有分支的彩虹樣的、封閉的環(huán)狀和網(wǎng)絡(luò)狀的通道（圖1）。

三、芪藍膠囊低劑量組VM形成的表現(xiàn)

芪藍膠囊低劑量組可見直的、平行排列的、十字交叉的、彩虹樣的(沒有完全封閉)、有分支的彩虹樣的通道，但數(shù)量較空白組少（圖2）。

四、芪藍膠囊中、高劑量組VM形成的表現(xiàn)

芪藍膠囊中、高劑量組僅見極少量直行通道形成，沒有明顯的立體管狀結(jié)構(gòu)（圖3）。

圖1 空白組VM形成的表現(xiàn)

圖2 芪藍膠囊低劑量組VM形成的表現(xiàn)

圖3 芪藍膠囊中、高劑量組VM的表現(xiàn)

討 論

VM作為一種腫瘤生長和進展的血液供應(yīng)模式之一[3]，早在1999年由Maniotis等[4]報道，隨著研究的深入認(rèn)為VM是腫瘤特別是早期腫瘤血液供應(yīng)的主要途徑。它是一種無內(nèi)皮襯覆的血液通道，是早期腫瘤的功能性微循環(huán)。隨著腫瘤的進展，VM逐漸演變成腫瘤細(xì)胞內(nèi)的馬賽克血管形式，最后隨著內(nèi)皮細(xì)胞的長入，形成了內(nèi)皮依賴性血管[5]。這種新的血供模式是腫瘤在自身高速發(fā)展的需要下，腫瘤細(xì)胞自身為獲取更多的血供而發(fā)生的變形，出現(xiàn)了管道樣的供血管道[6]。

目前3D培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)廣泛運用于腫瘤研究的實驗中，便于多方位觀察腫瘤細(xì)胞的組合形態(tài)，以及在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的生長方式。本實驗采用BeaverNano? 3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，以水凝膠作為PC-3細(xì)胞3D培養(yǎng)的支架，成功培養(yǎng)出一個從立體層面展現(xiàn)前列腺癌細(xì)胞VM生成狀態(tài)的實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

芪藍膠囊是成都中醫(yī)藥大學(xué)男科團隊經(jīng)過8年多的臨床總結(jié)和篩選，前期多項實驗研究和臨床觀察結(jié)果提示能夠有效改善前列腺癌患者下尿路癥狀、最大尿流率及提高患者生存質(zhì)量[7]，并于2015年成功獲得國家發(fā)明專利（發(fā)明專利號：ZL201310492315.8）。芪藍膠囊由黃芪、絞股藍、蜣螂、土茯苓、葫蘆巴5味藥物組成。組方緊扣氣血、寒溫共調(diào)之法，是其臨床療效的基本保障。方中重用黃芪為君，合絞股藍以補中焦之氣，調(diào)和氣血；土茯苓合葫蘆巴，寒溫并用，溫化水濕而不燥，清濕熱而不傷正；蜣螂善行易走，能入三焦，引藥入經(jīng)，直達病所。五藥合用，使整方具有能溫能補，不燥不滯，寒熱氣血兼顧的特點。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明：黃芪具有增強人體免疫、抑制腫瘤血管生成、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、增強其他抗腫瘤藥物療效以及促雌激素樣等作用[8,9]，黃芪能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，通過調(diào)控癌基因和抑癌基因，來影響蛋白的表達[10]。絞股藍能阻斷腫瘤細(xì)胞有絲分裂、干擾腫瘤細(xì)胞 DNA合成、提高抗基因突變的能力，其主要成分有皂苷、黃酮類、多糖等，對許多腫瘤細(xì)胞具有較為顯著的細(xì)胞毒樣作用[11,12]，其黃酮類化合物槲皮素對多種腫瘤具有抑制作用，有對抗自由基的作用，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性，調(diào)控抑癌基因和原癌基因，增強抗癌藥物的敏感性等[13]。土茯苓的現(xiàn)代藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)其內(nèi)含有糖類、皂苷、黃酮苷、有機酸等物質(zhì)，對荷瘤小鼠S180的實體瘤具有抑制作用[14]，能明顯增加大白鼠的排尿總量，從而具有利尿作用[15]，還具有抗血栓、細(xì)胞免疫抑制樣作用、抗菌、陣痛等作用[16]，故土茯苓對于PCa患者的排尿癥狀具有一定的改善作用。葫蘆巴的種子提取物可使雄性大鼠的精液質(zhì)量下降，呈現(xiàn)抗雄激素樣作用[17]，還具有抗炎、抗氧化、抗?jié)兊茸饔肹18]，故其抗前列腺腫瘤的機制一方面是其抗雄激素樣作用，另一方面是其本身的提取物對腫瘤細(xì)胞具有干預(yù)作用。蜣螂提取物可以通過抑制睪酮向雙氫睪酮轉(zhuǎn)化，從而阻斷其作為雄激素刺激前列腺增生的作用，同時對大鼠血清雌激素含量和雌/雄激素比例具有調(diào)節(jié)作用，明顯抑制前列腺的增生[19,20]。綜合組方藥物的現(xiàn)代藥理學(xué)科學(xué)地闡釋了芪藍膠囊治療前列腺癌的作用機制。

本實驗通過芪藍膠囊含藥血清的干預(yù)，結(jié)果證實了該藥能明顯抑制體外3D培養(yǎng)模型中前列腺癌細(xì)胞組織VM的形成，這種效果在中劑量、高劑量組體現(xiàn)的更為明顯。因而我們可以推測芪藍膠囊通過對前列腺癌組織中血管生成過程的抑制，延緩了腫瘤組織的發(fā)展，從而改善患者的臨床癥狀。由于缺乏一個長期的臨床觀察隨訪，因此這種對腫瘤組織發(fā)展的延緩作用是否能延遲腫瘤的轉(zhuǎn)變抑或延長患者的生存期，還需進一步的臨床探索。

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（2017-03-08收稿）

Effects of Qi-lan Capsule on vasculogenic mimicry in prostate cancer＊

Yu Xujun1, You Yaodong2, Li Junjun1, Chang Degui1, Yang Fang1, Dong Liang1, Wu Tianlang2**
1. Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610075 Sichuan, China;
2. The 1st Teaching Hospital, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine Corresponding author: Wu Tianlang, E-mail: wusu5356@163.com

ObjectionTo observe the effects of Qi-lan capsule on the formation of Vasculogenic mimicry in prostate cancer, and investigate its intervention effect on VM formation and the dose-effect relationship.MethodsProstate cancer cells (PC-3) were cultured using 3D cell culture method. The 3D PC-3 cells were randomly divided into four groups: blank control group, low dose group, medium dose group and high dose group. The cells in these groups were treated with pharmaceutic serum with different doses of Qi-lan capsule, and the treated cells were observed under electron microscope after 48 hours.ResultsThe VM formation in the blank group showed good tubular morphology. The number of VM in the low dose group of Qi-lan capsule was slightly less than that in the blank control group, and the lumen channel formation was acceptable. In the medium and high dose group, only a very small amount of straight channel formation was visible.ConclusionQi-lan capsule can effectively control the formation of VM in prostate cancer. VM was suppressed more markedly as dose increased.

Qi-lan capsule; prostatic neoplasm; vasculogenic mimicry; Dose-Response Relationship, Drug

10.3969/j.issn.1008-0848.2017.03.005

R 737.25

資助：國家自然科學(xué)基金青年基金項目（81503589）；四川省教育廳科技項目（14ZB0089）；四川省中醫(yī)藥管理局重大疑難疾病防治研究項目（項目批準(zhǔn)號：2012-A-095）

**通訊作者，E-mail: wusu5356@163.com