肥胖與雄性小鼠生殖系統(tǒng)慢性炎癥的相關(guān)性研究

徐雅麗張正清劉 悅丁之德*

1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)系（上海 200025）

2. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院檢驗(yàn)科

·論 著·

肥胖與雄性小鼠生殖系統(tǒng)慢性炎癥的相關(guān)性研究

徐雅麗1張正清2劉 悅1丁之德1*

1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)系（上海 200025）

2. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院檢驗(yàn)科

目的研究肥胖誘導(dǎo)的雄性小鼠生殖系統(tǒng)炎癥反應(yīng)以及相關(guān)分子機(jī)制。方法建立肥胖小鼠模型。通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)其睪丸和附睪內(nèi)促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子- α（tumor necrosis factor，TNF-α），炎癥小體3（NOD-like receptor family pyrin domain containing-3，NLRP3）的mRNA表達(dá)水平，運(yùn)用HE染色觀察肥胖小鼠睪丸組織的結(jié)構(gòu)變化，采用ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠血清中性激素，IL-6，TNF-α，皮質(zhì)酮，免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）以及免疫球蛋白M（Immunoglobulin M，IgM）濃度變化，最后通過(guò)Western blot檢測(cè)肥胖小鼠睪丸中炎癥反應(yīng)相關(guān)信號(hào)通路蛋白p38，核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）, 細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK），c-Jun氨基末端激酶（Jun N-terminal kinase，JNK）的含量變化。結(jié)果與正常組小鼠相比，肥胖小鼠睪丸和附睪內(nèi)IL-6，TNF-α和NLRP3的含量顯著上升，肥胖小鼠血清中性激素水平紊亂，表現(xiàn)為雌激素水平上升，睪酮和孕酮水平下降。血清中IL-6、TNF-α、皮質(zhì)酮、IgG和 IgM濃度也明顯增高。此外，肥胖小鼠睪丸發(fā)育異常，且睪丸中p38、NF-κB、ERK和JNK含量顯著上升。結(jié)論肥胖會(huì)誘導(dǎo)雄性小鼠睪丸和附睪發(fā)生炎癥反應(yīng)，而該炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致小鼠生育力的損傷。

小鼠, 肥胖; 睪丸 ; 附睪; 炎癥; 生育力

肥胖是一個(gè)全球性的健康問(wèn)題，在過(guò)去幾年中，肥胖的患病率大幅上升，2013年的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，世界范圍內(nèi)，超質(zhì)量和肥胖的人口數(shù)從1980年的8.57億上升到21億，其中超質(zhì)量男子的比例從1980年的28.8%上升到36.9%[1]。肥胖是一種行為和遺傳因素共同作用所導(dǎo)致的代謝性疾病，并與一些慢性疾病息息相關(guān)，包括代謝綜合征、高血脂、糖尿病、癌癥以及不孕癥等[2]。另一方面，過(guò)去幾年的調(diào)查顯示脂類代謝與機(jī)體的免疫功能關(guān)系密切[3]，并且這種代謝與免疫系統(tǒng)之間的相互作用是由免疫細(xì)胞和脂肪細(xì)胞共同調(diào)控[4]。研究表明，脂肪細(xì)胞功能紊亂很可能會(huì)引起全身性的炎癥反應(yīng)[5]，并且肥胖與一種慢性炎癥反應(yīng)有關(guān)，這種炎癥反應(yīng)的特征是促炎細(xì)胞因子，如腫 瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor, TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（interleukin-6, IL-6）等的分泌異常，以及促炎癥信號(hào)通路的激活[4]。有文獻(xiàn)報(bào)道，嚙齒動(dòng)物的脂肪細(xì)胞可以直接分泌TNF-α從而導(dǎo)致肥胖個(gè)體炎癥反應(yīng)的發(fā)生，這一發(fā)現(xiàn)與人類研究中顯示肥胖個(gè)體的脂肪組織中TNF-α含量增加，減肥后TNF-α隨之下降的現(xiàn)象相一致[6]。此外，炎癥小體3（NOD-like receptor family pyrin domain containing-3, NLRP3，NLRP3）炎癥小體也與肥胖和肥胖引起的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[7]。

近年來(lái)，有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)男性肥胖會(huì)降低精子質(zhì)量，進(jìn)而損害男性生育力[8-10]。然而，肥胖是如何對(duì)精子產(chǎn)生影響及其影響的機(jī)制如何？現(xiàn)有的文獻(xiàn)并無(wú)明確的答案。因此，本研究通過(guò)高脂飲食構(gòu)建肥胖小鼠模型模擬人類由不良生活方式所致的肥胖癥；其后通過(guò)觀察分析雄性肥胖小鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)的變化，并進(jìn)一步檢測(cè)睪丸和附睪等組織和血清中促炎細(xì)胞因子的表達(dá)水平及其相關(guān)信號(hào)通路來(lái)探討肥胖所致慢性炎癥對(duì)雄性生殖的不良影響。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料

雄性C57BL/6小鼠，3周齡，訂購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。10% fat Kcal%的對(duì)照組飼料（MD12031）和45% fat Kcal%的高脂組飼料（MD12032）訂購(gòu)于江蘇美迪森公司。

二、主要試劑與儀器

（一）試劑

Trizol（Invitrogen），逆轉(zhuǎn)錄酶DRR037A（TaKaRa），SYBR Premix Ex Taq (2x)（TaKaRa），ROX Reference Dye II （TaKaRa），雄激素檢測(cè)試劑盒（R&D Systems），雌激素檢測(cè)試劑盒（Cayman chemical），孕酮檢測(cè)試劑盒（Cayman chemical），皮質(zhì)酮檢測(cè)試劑盒（ALPCO），IgG 檢測(cè)試劑盒（ICL），IgM檢測(cè)試劑盒（ICL），TNF-α檢測(cè)試劑盒 (Anogen)，IL-6檢測(cè)試劑盒 (Anogen)，RIPA lysis buffer（Thermo Fisher Scientific），Protease Inhibitor tablet（Thermo Fisher Scientific），兔抗鼠actin抗體（Cell Signaling Technology），兔抗鼠p38抗體（Cell Signaling Technology），兔抗鼠NF-κB抗體（Cell Signaling Technology），兔抗鼠JNK抗體（Cell Signaling Technology），兔抗鼠ERK抗體（Cell Signaling Technology），辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG（Abgent）。

（二）儀器

數(shù)碼顯微鏡（Nikon E600），生化自動(dòng)分析儀（Roche Diagnostics），Applied Biosystems 7500（Thermo Fisher Scientific），全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 Multiskan GO（Thermo Fisher Scientifc），1000/500型電泳儀和轉(zhuǎn)移儀（Bio-Rad），凝膠圖像分析系統(tǒng)（Bio-Rad）。

三、方法

（一）肥胖小鼠模型構(gòu)建

購(gòu)置3周齡C57BL/6雄鼠60只于醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部飼養(yǎng)。將60只鼠隨機(jī)分為兩組，即正常飲食對(duì)照組（control diet，CD）和高脂飲食組（high-fat diet，HFD），每組各30只，且每籠中的小鼠均用苦味酸標(biāo)記，用以觀察不同組小鼠體質(zhì)量的改變。兩組小鼠在適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，CD組繼續(xù)給予正常飼料，而HFD組則給予高脂飼料，兩組小鼠每周測(cè)量體質(zhì)量一次并記錄，與此同時(shí)，記錄兩組小鼠每周攝食飼料的質(zhì)量，直至第14周。

（二）小鼠肝臟和睪丸形態(tài)學(xué)觀察

成功構(gòu)建肥胖小鼠模型后，對(duì)其過(guò)量麻醉處死，取其肝臟和睪丸組織并浸入Bouin氏液中固定過(guò)夜。后經(jīng)梯度乙醇脫水后進(jìn)行石蠟包埋，二甲苯脫蠟后梯度乙醇復(fù)水，室溫晾干后HE染色等步驟，最終經(jīng)中性樹(shù)膠封片后置于數(shù)碼顯微鏡下觀察并拍照。

（三）小鼠血脂水平檢測(cè)

小鼠麻醉后心臟取血，室溫靜置30 min后，置于小型臺(tái)式離心機(jī)中4 ℃，845×g，離心15min，吸取血清，分裝后置于-80 ℃低溫冰箱保存。待所有的血清收集完畢后送上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院檢驗(yàn)科檢測(cè)血脂水平。

（四）實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采用Trizol法分別提取睪丸、附睪頭部和附睪尾部的總RNA，并用RT Master Mix試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。引物設(shè)計(jì)采用PRIMER 5.0軟件，IL-6引物：上游引物5’-TTCTTGGGACTGATGCTGGT-3’，下游引物5’-CCTCC-GACTTGTGAAGTGGT-3’；TNF-α引物：上游引物5’-ACGGCATGGATCTCAA A G A C-3’，下游引物5’- G T G G G T GAGGAGCACGTAGT-3’；NLRP3引物：上游引物5’-CATCAATGCTGCTTCGACAT-3’，下游引物5’-T C A G T C C C A C A C AC A G C A AT-3’；β-a c t i n引物：上游引物5’-GGGAATGGGTCAGAAGGACT-3’，下游引物5’-CTTCTCCATGTCGTCCCAGT-3’。檢測(cè)系統(tǒng)為Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR，反應(yīng)條件為：stage1 預(yù)變性，Reps: 1, 95°C 30s；stage2 PCR反應(yīng)，Reps: 40, 95°C 5s, 60°C 34s；Dissociation Stage。通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)定的Ct值表示目的基因mRNA表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組目的基因表達(dá)量的相對(duì)變化水平使用2-△△Ct法分析表示。

（五）ELISA檢測(cè)小鼠血清中激素、IL-6、TNF-α、IgG和IgM水平

小鼠麻醉后心臟取血，室溫靜置30min后，4℃，845×g，離心15min，吸取血清。向預(yù)先包被有待測(cè)激素、IgG、IgM、TNF-α和IL-6抗體的96孔板中分別加入封閉液封閉孔中多余的蛋白結(jié)合位點(diǎn)，隨后，在孔中加入血清，待抗體吸附血清中的抗原且經(jīng)PBS緩沖液洗滌后，再向孔中加入生物素標(biāo)記的抗體吸附已結(jié)合的抗原，然后將鏈霉親和素-HRP加入待測(cè)孔結(jié)合生物素標(biāo)記的抗體，最后加入四甲基聯(lián)苯胺底物與HRP進(jìn)行顯色，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度獲得樣本數(shù)據(jù)。

（六）Western法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)水平

小鼠過(guò)量麻醉處死后，取一側(cè)睪丸置于勻漿器，使用RIPA裂解液抽提睪丸蛋白，采用BCA法檢測(cè)睪丸蛋白濃度。取30μg樣品蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳（濃縮膠90 V，約30 min；分離膠120 V，約1h），電泳后轉(zhuǎn)膜（350 mA, 90 min）。經(jīng)5%脫脂牛奶室溫?fù)u床封閉1 h，加稀釋后一抗（actin 1:1000，p38 1:1000, NF-κB 1:1000, JNK 1:1000, ERK 1:1000）孵育過(guò)夜，隨后洗滌去除一抗，加1:10000羊抗兔二抗室溫孵育1 h，洗滌。用凝膠圖像分析系統(tǒng)曝光待測(cè)蛋白得到目的蛋白條帶圖。

（七）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SAS 8.2統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，應(yīng)用單因素方差分析對(duì)每組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、兩組小鼠體質(zhì)量、攝食量、肝臟形態(tài)及血脂水平分析

雄性C57BL/6小鼠在高脂飲食喂養(yǎng)10周后（鼠齡14周），與CD組小鼠相比體質(zhì)量呈現(xiàn)顯著增加，而HFD組小鼠每周的攝食量均少于CD組。CD組與HFD組小鼠的體質(zhì)量在喂養(yǎng)4周后（鼠齡第8周）便開(kāi)始出現(xiàn)差異，分別為（26.29±1.05）g和（31.63±1.96）g，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且該差異隨喂養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)愈加顯著（圖1A，圖1B）。

小鼠肝臟切片HE染色的形態(tài)學(xué)分析顯示，與CD組相比，HFD組小鼠肝臟的肝細(xì)胞均出現(xiàn)脂肪空泡化現(xiàn)象，表現(xiàn)為嚴(yán)重的脂肪肝病變（圖1C）。

圖1 CD組和HFD組小鼠每周體質(zhì)量、攝食量及肝臟HE切片

血脂水平分析表明：HFD組小鼠血清總膽固醇（CHOL）水平為（4.36±0.11）mmol/L，高密度脂蛋白（HDL）水平為（2.16±0.04）mmol/L，低密度脂蛋白（LDL）水平為（0.47±0.06）mmol/L，與CD組（分別為（2.30±0.11）mmol/L，（1.47±0.07）mmol/L和（0.26±0.02） mmol/L）比較均顯著上升，差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；但兩組的甘油三酯（TGL）水平相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），HFD組和CD組的TGL水平分別為（1.19±0.05）mmol/L和（1.16±0.10）mmol/L。此外，HFD組和CD組的載脂蛋白B（ApoB）濃度分別為（0.08±0.03）g/L和（0.05±0.007）g/L，載脂蛋白E（ApoE）濃度分別為（5.18±0.86）mg/dL和（2.46±1.00）mg/dL，HFD組均表現(xiàn)顯著上升，與CD組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖2）。

二、小鼠血清性激素水平變化

ELISA結(jié)果顯示：HFD組小鼠血清中雌激素水平[（16.74±1.06）pg/mL]，與CD組（9.14±2.58）pg/mL相比，顯著上升；睪酮水平[（4.58±1.44）ng/mL]，與CD組（7.95±0.80）ng/mL相比，顯著降低，差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；同時(shí)孕酮水平[（10.38±1.43）pg/mL]，與CD組（12.76±1.62）pg/mL相比，也顯著降低，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖3）。

圖2 CD組和HFD組小鼠血脂水平的變化

圖3 CD組和HFD組小鼠性激素水平變化

三、兩組小鼠睪丸形態(tài)學(xué)分析以及IL-6、TNF-α和NLRP3 mRNA在小鼠睪丸和附睪中相對(duì)表達(dá)水平變化

小鼠睪丸切片HE染色的形態(tài)學(xué)分析顯示，HFD組小鼠的生精上皮嚴(yán)重萎縮，且支持細(xì)胞和生精細(xì)胞之間的細(xì)胞連接被破壞，排列松散（圖4）。同時(shí)，Real-Time PCR結(jié)果顯示，與CD組相比（相對(duì)表達(dá)量取為1），HFD組小鼠睪丸IL-6的mRNA表達(dá)水平（3.7±0.83），TNF-α的mRNA表達(dá)水平（2.24±0.50）和NLRP3的mRNA表達(dá)水平（2.42±0.51）；HFD組小鼠附睪頭部IL-6的mRNA表達(dá)水平（3.05±0.79），TNF-α的mRNA表達(dá)水平（1.90± 0.17）和NLRP3的mRNA表達(dá)水平（1.51±0.16）；HFD組小鼠附睪尾部IL-6的mRNA表達(dá)水平（3.85±0.71），TNF-α的mRNA表達(dá)水平（2.80±0.61）和NLRP3的mRNA表達(dá)水平（2.45±0.20）均有顯著上升，差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖5）。

圖4 CD組和HFD組小鼠睪丸HE切片

圖5 CD組和HFD組小鼠睪丸和附睪內(nèi)IL-6、TNF-α和NLRP3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平

四、兩組小鼠血清IL-6、TNF-α、皮質(zhì)酮以及IgG、IgM水平變化

ELISA結(jié)果顯示：HFD組小鼠血清中IL-6和TNF-α濃度分別為（9.50±0.43）pg/mL和（30.91±2.03）pg/mL，與CD組[IL-6和TNF-α濃度分別為（5.37±0.32）pg/mL和（18.18±0.59）pg/mL]相比，顯著升高，差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。HFD組的皮質(zhì)酮和IgG濃度也顯著上升，分別為（165.75±10.68）ng/mL和（6227.40±713.48）μ g/m L，與C D組[皮質(zhì)酮和I g G濃度分別為（115.93±10.47）ng/mL和（3620.39±439.70）ng/mL]相比，差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。兩組的IgM濃度無(wú)顯著變化（圖6）。

五、肥胖對(duì)炎癥反應(yīng)信號(hào)通路相關(guān)蛋白含量的影響

P38, NF-κB, JNK和ERK均為TNF-α下游的重要信號(hào)分子，也是在免疫反應(yīng)中研究較多的具有代表性的重要信號(hào)蛋白，并且也與雄性動(dòng)物血睪屏障的完整性密切相關(guān)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與CD組小鼠相比，HFD組小鼠睪丸內(nèi)，P38, NF-κB, JNK和ERK表達(dá)水平均顯著上升（圖7）。

討 論

我們?cè)谇捌诘难芯恐幸呀?jīng)證實(shí)了高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖會(huì)損害雄鼠的精子功能，進(jìn)而損傷雄性的生育力[11,12]。為了明確肥胖是否通過(guò)引起雄鼠生殖道炎癥進(jìn)一步影響其生育力這一設(shè)想，我們首先構(gòu)建肥胖小鼠模型，經(jīng)過(guò)10周的高脂喂養(yǎng)，HFD組小鼠呈現(xiàn)出明顯的體質(zhì)量上升，脂肪肝病變以及血脂中膽固醇、低密度脂蛋白及載脂蛋白B和E等水平顯著上升。然而血清甘油三酯水平并未上升，推測(cè)主要因素是給予小鼠的高脂飼料中其主要脂類成分為豬油，而豬油中含有大量的膽固醇，因此相比較于正常小鼠，肥胖小鼠的血清總膽固醇有顯著性升高；而另一方面，受即食影響的血清甘油三酯水平卻無(wú)明顯變化，這也進(jìn)一步說(shuō)明我們建立的肥胖小鼠模型是一個(gè)脂類代謝長(zhǎng)期紊亂的表型。其次，伴隨肥胖，小鼠出現(xiàn)內(nèi)分泌紊亂即性激素水平異常的現(xiàn)象。性激素水平檢測(cè)結(jié)果顯示，肥胖小鼠的雌激素水平顯著升高，而雄激素與孕酮水平顯著降低。研究發(fā)現(xiàn)，性類固醇激素如雌激素、睪酮和孕酮有許多重要的生理功能，包括生殖、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡以及對(duì)微生物和病毒感染的反應(yīng)[13]。此外，性類固醇激素對(duì)免疫細(xì)胞的活性有顯著的調(diào)節(jié)作用，如睪酮能降低促炎細(xì)胞因子TNF-α的合成[14]，雌激素通過(guò)刺激促炎細(xì)胞因子IL-6和TNF-α來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)[15,16]，另外孕酮對(duì)NF-κB的激活有顯著的抑制作用[17]。與之相對(duì)應(yīng)的是，我們通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)小鼠睪丸和附睪內(nèi)的促炎細(xì)胞因子水平，結(jié)果顯示IL-6，TNF-α和NLRP3的表達(dá)水平在肥胖小鼠中均有顯著升高，同時(shí)，ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明肥胖小鼠血清中的IL-6和TNF-α濃度也有明顯的上升。除此外，與正常小鼠相比，肥胖小鼠血清中的皮質(zhì)酮和IgG濃度均有顯著增高。在機(jī)體受感染時(shí)，炎癥反應(yīng)會(huì)通過(guò)激活下丘腦-垂體-腎上腺（hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA）軸促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)分泌大量皮質(zhì)酮，這是機(jī)體在感染應(yīng)激時(shí)發(fā)生的重要生理反應(yīng)[18]，皮質(zhì)酮可以通過(guò)抑制促炎介質(zhì)的表達(dá)或刺激抗炎介質(zhì)的表達(dá)而發(fā)揮抗炎作用[19]。因此，這一結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了肥胖會(huì)導(dǎo)致小鼠機(jī)體炎癥反應(yīng)的發(fā)生。一般狀況下，IgM是初次體液免疫應(yīng)答中最早出現(xiàn)的抗體，多產(chǎn)生于早期感染階段，當(dāng)機(jī)體處于急性炎癥反應(yīng)階段時(shí)體內(nèi)IgM濃度較高，而IgG是再次免疫應(yīng)答產(chǎn)生的主要抗體，多產(chǎn)生于感染后期，即慢性炎癥反應(yīng)階段[20]。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，與正常小鼠相比，肥胖小鼠血清中IgM含量并無(wú)顯著性改變，而IgG含量較高，故肥胖誘導(dǎo)小鼠機(jī)體產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)為慢性炎癥反應(yīng)而非急性炎癥反應(yīng)。

圖6 CD組和HFD組小鼠血清中IL-6、TNF-α、皮質(zhì)酮、IgG和IgM濃度變化

圖7 CD組和HFD組小鼠睪丸中炎癥反應(yīng)相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化

為了進(jìn)一步探討肥胖引起的炎癥對(duì)雄性小鼠生育力的影響，我們對(duì)小鼠睪丸進(jìn)行了HE染色分析，結(jié)果顯示肥胖小鼠睪丸生精小管內(nèi)生精上皮嚴(yán)重萎縮，并且支持細(xì)胞和生精細(xì)胞間的細(xì)胞連接被破壞，排列松散。因此，高脂飲食所誘導(dǎo)的小鼠肥胖會(huì)導(dǎo)致全身包括生殖道的炎癥反應(yīng)，其結(jié)果可使肥胖小鼠的睪丸發(fā)育出現(xiàn)異常。

大量研究顯示TNF-α在對(duì)炎癥反應(yīng)發(fā)生過(guò)程[21]和炎癥反應(yīng)信號(hào)通路中的其他分子，如p38、NF-κB、JNK和ERK等激活過(guò)程有著重要作用[3]。另一方面，在小鼠的支持細(xì)胞中，TNF-α通過(guò)激活NF-κB誘導(dǎo)Fas表達(dá)上調(diào)，F(xiàn)as又稱APO-1（apoptosis-1），是位于細(xì)胞膜上的一個(gè)受體，可以啟動(dòng)凋亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，觸發(fā)細(xì)胞凋亡從而導(dǎo)致血睪屏障損傷[22]。此外，在小鼠睪丸中，有絲分裂原活化蛋白酶（MAPK）與血睪屏障結(jié)構(gòu)的完整性也密切相關(guān)，而MAPK這一反應(yīng)途徑具有3個(gè)分支的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，這3個(gè)分支包括p38、ERK和JNK 3條信號(hào)通路[23]。在我們的研究中，雄性肥胖小鼠睪丸內(nèi)的p38、NF-κB、JNK和ERK蛋白水平明顯高于正常組小鼠，表明肥胖誘導(dǎo)的生殖系統(tǒng)炎癥反應(yīng)可造成睪丸內(nèi)除促炎細(xì)胞因子TNF-α水平上升。TNF-α水平上升后，可誘導(dǎo)其下游信號(hào)分子p38、NF-κB、JNK和ERK蛋白表達(dá)水平升高，而這些蛋白均與血睪屏障的完整性密切相關(guān)。此外，在我們的前期研究[11]顯示：相比于正常小鼠，肥胖小鼠的血睪屏障完整性受損，且與雌鼠交配后產(chǎn)仔率顯著下降。因此可推測(cè)，炎癥除導(dǎo)致肥胖小鼠睪丸內(nèi)TNF-α水平上升外，可進(jìn)一步引起p38、NF-κB、JNK和ERK蛋白水平升高，其結(jié)果會(huì)造成血睪屏障結(jié)構(gòu)的完整性被破壞，損傷其生精功能，最終導(dǎo)致雄性小鼠生育力下降。因此，通過(guò)本項(xiàng)研究對(duì)肥胖誘導(dǎo)的雄性生殖系統(tǒng)炎癥反應(yīng)及機(jī)制進(jìn)行探討，可為今后更全面深入闡明肥胖對(duì)雄性生育力的調(diào)控提供了新的理論基礎(chǔ)和重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 Ng M, Fleming T, Robinson M, et al. Global, regional, and national prevalence of overweight and obesity in children and adults during 1980-2013: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2013. Lancet 2014; 384(9945): 766-781

2 Practice Committee of American Society for Reproductive Medicine: Obesity and reproduction: an educational bulletin. Fertil Steril 2008; 90(5 Suppl): S21-29

3 Tilg H, Moschen AR: Adipocytokines: mediators linking adipose tissue, inflammation and immunity. Nat Rev Immunol 2006; 6(10): 772-783

4 Wellen KE, Hotamisligil GS. Inflammation, stress, and diabetes. J Clin Invest 2005; 115(5): 1111-1119

5 Esser N, Legrand-Poels S, Piette J, et al. Infammation as a link between obesity, metabolic syndrome and type 2 diabetes. Diabetes Res Clin Pract 2014, 105(2): 141-150

6 Kern PA, Saghizadeh M, Ong JM, et al. The expression of tumor necrosis factor in human adipose tissue. Regulation by obesity, weight loss, and relationship to lipoprotein lipase. J Clin Invest 1995; 95(5): 2111-2119

7 Vandanmagsar B, Youm YH, Ravussin A, et al. The NLRP3 inflammasome instigates obesity-induced infammation and insulin resistance. Nat Med 2011; 17(2): 179-188

8 Teerds KJ, de Rooij DG, Keijer J. Functional relationship between obesity and male reproduction: from humans to animal models. Hum Reprod Update 2011; 17(5): 667-683

9 Hammiche F, Laven JS, Twigt JM, et al. Body mass index and central adiposity are associated with sperm quality in men of subfertile couples. Hum Reprod 2012, 27(8): 2365-2372

10 Kloting N, Bluher M. Adipocyte dysfunction, inflammation and metabolic syndrome. Rev Endocr Metab Disord 2014; 15(4): 277-287

11 Fan Y, Liu Y, Xue K, et al. Diet-induced obesity in male C57BL/6 mice decreases fertility as a consequence of disrupted blood-testis barrier. PLoS One 2015, 10(4): e0120775

12 Liu Y, Zhao W, Gu G, et al. Palmitoyl-protein thioesterase 1 (PPT1): an obesity-induced rat testicular marker of reduced fertility. Mol Reprod Dev 2014; 81(1): 55-65

13 Edwards DP. Regulation of signal transduction pathways by estrogen and progesterone. Annu Rev Physiol 2005; 67: 335-376

14 McKay LI, Cidlowski JA. Molecular control of immune/ inflammatory responses: interactions between nuclear factor-kappa B and steroid receptor-signaling pathways. Endocr Rev 1999; 20(4): 435-459

15 Straub RH. The complex role of estrogens in infammation. Endocr Rev 2007; 28(5): 521-574

16 Vegeto E, Pollio G, Pellicciari C, et al. Estrogen and progesterone induction of survival of monoblastoid cells undergoing TNF-alpha-induced apoptosis. FASEB J 1999; 13(8): 793-803

17 Su L, Sun Y, Ma F, et al. Progesterone inhibits Tolllike receptor 4-mediated innate immune response in macrophages by suppressing NF-kappaB activation and enhancing SOCS1 expression. Immunol Lett 2009; 125(2): 151-155

18 Reincke M, Allolio B, Wurth G, et al. The hypothalamicpituitary-adrenal axis in critical illness: response to dexamethasone and corticotropin-releasing hormone. JClin Endocrinol Metab 1993; 77(1):151-156

19 Barnes PJ. Anti-infammatory actions of glucocorticoids: molecular mechanisms. Clin Sci (Lond) 1998; 94(6): 557-572

20 周光炎. 免疫學(xué)原理. 上海: 上海科學(xué)技術(shù)出版社, 2007: 55

21 Azenabor A, Ekun AO, Akinloye O. Impact of Inflammation on Male Reproductive Tract. J Reprod Infertil 2015; 16(3): 123-129

22 Starace D, Riccioli A, D'Alessio A, et al. Characterization of signaling pathways leading to Fas expression induced by TNF-alpha: pivotal role of NF-kappaB. FASEB J 2005; 19(3): 473-475

23 Lie PP, Cheng CY, Mruk DD. Signalling pathways regulating the blood-testis barrier. Int J Biochem Cell Biol 2013; 45(3): 621-625

（2017-03-08收稿）

The correlation between obesity and inflammation in male mice genital tract

Xu Yali1, Zhang Zhengqing2, Liu Yue1, Ding Zhide1*
1. Department of Anatomy, Histology and Embryology, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200025, China; 2. Department of Clinical Laboratory, Shanghai 9th People's Hospital Corresponding author: Ding Zhide, E-mail: zding@shsmu.edu.cn

ObjectiveTo investigate the infammatory situation in obesity-induced male genital tract, and analyze its related mechanisms.MethodsThe obese mouse model was established by high fat diet. The expressions of IL-6、TNF-α and NLRP3 in testis and epididymis were detected by real-time PCR. Morphology of testis were observed by histological analysis. The concentration of sex hormones,IL-6,TNF-α,corticosterone,IgG and IgM in serum were detected by ELISA and the expressions of p38、NF-κB、ERK and JNK in testis were analyzed by western blot.ResultsCompared with those in the normal diet control group, the levels of IL-6,TNF-α and NLRP3 were remarkably increased in obese mice' testis and epididymis. Moreover, there was a disorder of sex hormones including decrease of testosterone and progesterone and increase of estradiol. On the other hand, the concentration of IL-6, TNF-α, corticosterone, IgG and IgM in serum were higher in obese mice than those in the controls. Besides, testes morphological analysis of obese mice exhibited an abnormal testicular structure. Meanwhile, P38, NF-κB, JNK and ERK expressions were increased in testicular tissue of obese mice in response to high-fat treatment.ConclusionObesity might result in the infammation in male genital tract, which could impair male fertility.

mice, obese; testis; epididymis; infammation; fertility

10.3969/j.issn.1008-0848.2017.03.001

R589.25; R698

*通訊作者, E-mail: zding@shsmu.edu.cn